Способ приготовления инкубационной среды для потенциометрического определения активности @ -атф-азы

 

1. СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИНКУБАЦИОННОЙ СРЕДЫ Д)1Я ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ Н -АТФ-АЗЫ, включающий взвешивание компонентов, растворение их в дистиллированной воде,, доведение рН раствора до 8,3iO,1, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности фермента, для растворения компонентов используют дистиллированную воду, предварительно обработанную постоянным электрическим током в электролизере с полупроницаемой мембраной при напряжении на электродах 300-600 В и силе тока 10-30 мА в течение 5-30 мин, при этом использую.т воду из катодной полови- . ны электролизера, а доведение рН среды осуществляют добавлением воды i из обеих половин электролизера, после чего инкубационную среду защищают слоем жидкого индифферентного гидрофобного газонепроницаемого вещества . 2. Способ non.t, отличающийся тем, что для запреты инкубационной Среды используют вазелин. Слд СО СП СО 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3476870/28-13 (22) 23 ° 07.82 (46) 07.01.85. Бюл.У 1 (72) В,Ф.Давыдов, E.M.Õâàòîâà, Э.В.Ягутов, П.П,Загоскин и И.Н,Бали-шина (71) Горьковский медицинский институт им.С.М.Кирова (53) 577.15(088.8) (56) 1. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты.

М., 1961, 37.

2. Болдырев А.А., Лебедев А.В., Ритов Б.В., О методе одновременной регистрации аденозинтрифосфатазных ! и Са — насасывающих свойств ферментов саркоплазматического ретикулума.

II

- Вопросы медицинской химии, 1969, п т. 15, вып.6, 622-626. (54)(57) 1, СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИНКУБАЦИОННОИ СРЕДЫ ДИ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

Н -АТФ-АЗЫ, включающий взвешивание

„.SU„„1133534 A

4(51) G 01 N 27/26 // С 12 1/42 компонентов, растворение их в дистиллированной воде,, доведение рН раствора до8,3+0,1, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности фермента, для растворения компонентов используют дистиллированную воду, предварительно обработанную постоянным электрическим током в электролиэере с полупроницаемой мембраной при напряжении на электродах 300-600 В и силе тока

10-30 мА в течение 5-30 мин, при этом используют воду из катодной половины электролизера, а доведение рН среды осуществляют добавлением воды из обеих половин электролизера, после чего инкубационную среду защищают слоем жидкого индифферентного гидрофобного газонепроницаемого вещества, 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что для защиты инкубационной среды используют вазелин.

3 11 инкубационную среду защищают слоем. жидкого индифферентного гидрофобного газонепроницаемого вещества.

При этом для защиты инкубационной среды используют вазелин.

Известно, что в электролизере, разделенном полупроницаемой мембраной, в катодной половине дистиллированная вода приобретает щелочные свойства по реакции катод 2Н20+2е- 20Н +Н2, а в анодной половине — кислотные свойства: анод )2Н 0 — ))е- 4Н +О f..

2 2

Смешивая под контролем рН-метра воду .из, обеих половин электролизе.ра, можно получить дистиллированную воду с любым значением рН.в диапазоне от 3,0 до 11 0. Растворяя в такой воде компоненты, необходимые для осуществления ферментативной реакции, и доводя рН полученной среды до оптимального значения водой из разных половин злектролизера, по" лучают готовую инкубационную среду с необходимым значением рН без внесения каких бы то ни было ионов, кроме Н и ОН, Проводить обработку постоянным электрическим током самой инкубационной среды с целью получения оптимальных значений рН,нецелесообразно, так как во время про" хождения электрического тока наблюдаются существенные изменения концентраций компонентов среды, являющихся электролитами (неорганические соли, диссоциируюг ие субстраты, кофакторы и т.д.) .

Для оптимального течения процесса необходимым является напряжение в пределах 300-600 Б и ток силой

10-30 мА. Время пропускания тока через дистилированную воду, равное

5-30 мин, достаточно для получения рН в пределах от 3,0 до )1,0 в анодной и катодной половинах соответственно.

Использование напряжения до

200-250 В и тока до 10 мА удлиняет время получения нужных значений рН. до 40-60 мин. Напряжение выше 60 В и сила тока выше 30 мА способствук>т при прохождении тока высокому разогреву воды pb 40-60 С, что существен

0 но влияет на точность измерения рН.

Таким образом, получают инкубационную среду со строго заданным значением рН без добавления каких-либо химических реактивов (буфера, силь33534 4 ных кислот или оснований), оказы> вающих влияние на сдвиг рН в ходе ферментативной реакции и- тем самым вносящих ошибку в измерение, т.е. впервые создана возможность измерения интенсивного сдвига рН в ходе потенциометрического определения активности ферментов.

Готовую инкубационную среду необходимо защитить слоем жидкого индифферентного гидрофобного газонепро5

10 ницаемого вещества, например вазели нового масла. В противном случае полученное оптимальное значение рН неуклонно изменяется.

Вещество должно быть жидким (для обеспечения защиты всей поверхности жидкой инкубационной средь, индиф-. ферентным (для предотвращения неже- лательного влияния на инкУбационнУю среду -и исследуемый фермент), гидрофобным (для предотвращения растворения его в инкубационной среде) и газонепроницаемым (для предовращения изменений рН под влиянием рН-акгивных газов атмосферы С02, NH и др.) .

Перечисленным требованиям удовлет воряет вазелиновое масло. При защите им инкубационная среда сохраняет необходимое рН в течение 8-10 ч.

Изобретение позволяет повысить точность и чувствительность определения активности ферментов при одновременном упрощении способа и экономии реактивов и иссследуемого фермента.

Предлагаемый способ, осуществляют следующим образом.

Взвешивают компоненты инкубацион-. ной среды в соответствии с ее про 0 писью, исключая буфер. В электролиэер, состоящий из двух половин емкостью по 100 мп каждая, разделенных полупроницаемой перегородкой (целлофан, брезент и т.n.) или сое45 диненных проводником второго рода (бинт, смоченный дистиллированной водой), заливают дистиллированную воду. В обе полонины помещают платиновые электроды и подключают их

50 к источнику. регулируемого .постоянного напряжения. Подают на электроды рабочее напряжение, равное 300-600 В.

Возникающий при этих условиях ток равен 10-30 мА и рН дистиллированной

55 воды в анодной н катодной половинах электролизера изменяется в пределах

3,0-4,0 и 10,0-11,0 соответстввнно в течение 5-30 мин.

1133534

Для предотвращения изменений рН под влиянием рН-активных газов атмосферы (СО,ХН и др.) защищают поверхность анодной и катодной" воды слоем жидкого индифферентного гидрофобного газонепроницаемого вещества, например вазелинового масла, толщиной 1-2 мм. Такой прием позволяет стабилизировать полученные значения рН с точностью до 0 01 в течение 8-10 ч, что является достаточным для проведения большого количества экспериментов.

Смешивают- контролем рН-метра части объемов"анодной" и "катодной" воды до получения оптимального для ферментативной реакции значения рН и защищают слоем вазелинового масла.

Эта порция необходима для будущего доведения до конечного объема полученной инкубационной среды с таким же оптимальным значением рН.

В мерном стакане на 100 мл, помещенном на магнитную мешалку, растворяют приготовленную навеску компонентом инкубационной среды в дистиллированной воде ("катодной" или

"анадной" ), доводя рН смеси под контролем рН-метра до требуемого оптимального значения. Доводят объем данной смеси до метки с помощью,воды, обработанной электрическим током по предлагаемому способу, и защищают слоем ваэелинового масла. При. готовленная смесь является инкубационной средой с оптимальным значением рН для исследуемой ферментатнвной реакции (на 10-20 анализов).

В электрохимическую ячейку емкостью 5-!О мл, помещенную на магнит. ную мешалку, отмеривают необходимый объем инкубационной среды, погру- жают в нее электроды рН-метра, защищают слоем вазелинового масла и записывают на самописце, подклю,ченном.к выходу рН-метра, исходное значение рН (базовую линию).

Под слой вазелинового масла в инкубационную среду вводят микрообъем (0,01-0,05 мп) исследуемого фермеытного препарата и автоматически записывают динамику сдвига рН,,характеризующего кинетику. ферментативной реакции..На период записи магнитную мешалку отключают.

По диапазону сдвига рН определяют активность фермента, используя известные методы расчета.

Пример. Определение активнос" ти Н+АТФ-азы митохондрий мозга крыс.

Взвешивают 1) мг АТФ (фирмы "Kea-.

nal", мол.в. 551,15) и 4,9 магния сульфата (Ма$0 7Н О марки х.ч., мол.в. 246,31 в мерном стаканчике на 100 мп (навеска на десять проб}, конечная концентрация АТФ и MgS04 7Н О в инкубационной среде должна быть

0,2 мМ.

В два стеклянных стаканчика емкостью по 200 мп наливают по 90 мл дистиллированной воды, опускают в них концы проводника второго рода †(бинт длиною 20 см, сложенный вчетверо, смо.— ченный той же дистиллированной водой), погружают платиновые электроды (платина марки 99,997-ной чистоты),представляющие собой проволоку длиной

10 см толщиной 1 мм с общей площадью 314 мм каждый, подключают их к источнику постоянного регулируемого напряжения (УИП-1) и в течение 10 мин подают на электроды рабочее напряжение 600 B.

Контролируют значение полученного рН воды в стаканчике, подключенном к катоду, рН-метром марки ЭВ-74.

В течение 10-минутного пропускания тока рН должен стать при этих условиях равным 10,8-11,0. В случае полу. чения меньших значений рН продолжают электролиз в течение 2-3 мин. Защищают поверхность полученной воды с рН, равным 10,8-11,0, слоем вазелинового масла.

В стаканчике емкостью 100 мп смешивают под контролем рН-метра части объемов "анодной" и "катодной" воды (общее количество около 60 мл) с тем, чтобы получить значение рН, соответствующее оптимуму (3,3)активности

Н -АТФ"зы. Защищают слоем вазелина+ вого масла, Эта порция использована для доведения до необходимого по ме-. тодике объема приготовленной инкубационной среды.

В мерном стаканчике на 100 мп, помещенном на магнитную мешалку, растворяют приготовленную навеску

АТФ и магния сульфата в воде с рН

10,8-11,0. Под контролем рН-метра доводят значение рН до 8,3. Оставшийся до метки 100 мл объем доводят водой с рН 8,3. Защищают вазелнновым маслом, В электрохимическую ячейку емкостью 10 мп, помещенную на магнитную мешалку, отмеривают 7 мл инкубацион3534

Таблица l

600

Время, мин

40

30 20 5

Таблица2

Параметр

20

0 018+0 00 l

71+ 2

0,09+0,002

13+1

7 113 ной среды (объем, достаточный для погружения электродов рН-метра), погружают электроды, защищают поверхность вазелиновым маслом. Записывают на самопишущем ампервольтметре Н-339, подключенном к выходу рН-метра, базовую линию, соответствующую исходному значению рН 0,3, Под слой вазелинового масла с помощью микрошприца MU-1 вводят 0,01 мл суспензии митохондрий мозга крысы, приготовленной на 0,25 М растворе сахарозы стандартным методом дифференциального центрифугирования.

Конечная концентрация белка митохондрий в пробе равна 0,04 мг/мп. Автоматически записывают динамику изменения Н среды,в течение 1-2 мин с выключенной мешалкой (фиг,1), По величине сдвига рН определяют активность Н АТФ-азы в единицах

apH/аt она равна 0,086 за 1 мин (фиг. 1) .

После проведения каждого анализа ячейку и электроды обрабатывают спиртом и отмывают дистиллированной водой. Как показали многочисленные эксперименты, такая обработка не влияет на точность показаний рНметра.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа определена активность

Н -АТФ-азы митохондрий мозга крыс.

При этом измерен истинный, не замаскированный" буфером сдвиг рН в ходе ферментативной реакции, который составил 0,086 за 1 мин (при использовании буферной инкубационной среды в контрольном эксперименте сдвиг рН составил 0,017 за 1 мин) . Расход исследуемого фермента и реактивов для приготовления инкубационной среды снижен в 10 раз.

Предлагаемым способом проведено

60 экспериментов по определению

+ активности Н -АТФ-зы митохондрий

Количество определений

Величина сдвига рН эа 1 мин на линейном участке

Время сдвига рН на 0,01 ед., с мозга крыс. Во всех случаях инкубационная среда с требуемым значением рН (от 7,5 до 8,5 ) была получена без добавления каких-либо химических реакторов, в частности буфера, и нейтрализующих кислот и щелочей.

Инкубационную среду со значением рН 7,5-8,5 с точностью .до 0,01 ед рН

1получали на основе дистиллированной воды, обработанной постоянным электрическим током. Полученное значение рН среды отличалось стабильностью и сохранялось 8-10 ч.

В приведенном примере использовались напряжение на электродах

600 В, сила тока 30 мА, время обработки воды 5 мин. Колебания этих параметров в пределах указанного интервала.не влияют на точность и чувствительность метода,а определяют лишь. продолжительность обработки током.

Зависимость времени, необходимого для получения рН дистиллированной воды со значением 10,8-11,0 от при— лагаемого напряжения приведена в табл.l.

Проведено сравнительное испытание двух способов определения актив+

40 ности Н -АТФ-азы митохондрий мозга крыс: безбуферного (предлагаемого/ способа, основанного на использовании электрохимически обработанной дистиллированной воды, и известного

45 (буферного) способа. Результаты испытаний приведены в табл.2.

9 1133

Как видно из табл.2, величина сдэига рН за один и тот же.произвольно выбранный промежуток времени в 5 раз больше при определении активности фермента.безбуферным методом, а время сдвига рН 0,01 ед, -рН приблизительно во столько же раз меньше, чем при определении, известным потенциометрическим.способом с иснользованиемт иС -НС1 буфера. f0

На фиг.1-5 приведены наиболее типичные примеры определения активности Н -АТФ-азы митохондрий мозга

-1. предлагаемым и известным способами.

Как видно иэ диаграммы на фиг.1, автоматически записанные изменения рН в ходе энзиматического гидролиза

АТФ представляют собой прямую линию практически на всем протяжении диаграммной ленты (участок AB записи), 20 что является черезвычайно важным для точности расчета основного кинетического параметра реакции — ее начальной скорости V ° Метод является весьма чувствительным, так как добавление незначительных -количеств фермента вызывает большой сдвиг рН, что увеличивает крутизну наклона кинетической кривой.

Добавление вместо митохондрии

O,О1 мл раствора сахароза,(контроль} не вызывает изменений рН за время регистрации (фиг.2).

На фиг.3 представлена кинетическая запись активности Н-АТФ-азы

Ф митохондрий мозга крыс в инкубацион35 ной среде, приготовленной на обычной дистиллированной воде, значение рН которой получено при помощи

0,3 мМ трис-НС1-буфера. Как следует из диаграммы, линейность записи (участок АВ) сохраняется лишь приблизительно на !/3 части ширины диаграм. мной ленты, что снижает точность расчета начальной скорости реакции.

Кроме того, чувствительность данного способа значительно ниже, о чем свидетельствует существенно более пологий характер кинетической кривой.

Предлагаемый способ определения

50 активности ферментов может быть использован . для. проведения ингибид ного анализа (фиг.4 и 5), Введение. в инкубационную среду в процессе ее. приготовления 5 мкг олигомицина, являющегося известным ингибитором -митохондриальной Н -AT

-аэы, отчетливо тормозит энзимати534 lO ческий гидролиз АТФ, что видно по резкому снижению крутизны падения рН в присутствии олигомнцина (фиг.4 и 5), На фиг.1 показана кинетическая запись активности Н -АТФ-азы митохондрий мозга крыс в беэбуферной инкубационной среде, приготовленной на дистилированной воде, подвергнутой электрохимической обработке (состав инкубационной смеси: 0,2 мМ

АТФ и 0,2 мМ МдБО4 7Н О, исходное значение рН 8,3, температура 25 С, O стрелкой обозначен момент добавления взвеси митохондрий, приготовленный на 0,25 M сахароэе, А — линейный участок записи) . На фиг.2 показана контрольная. диаграмма, отражающая изменение рН при введении вместо исследуемого фермента такого же объема сахарозы {стрелкой указан момент добавления 0,25 M раствора сахарозы) .

На фиг.3 показана кинетическая запись активности Н -АТФ-аэы митохон.

+ дрий мозга крыс в буферной инкубационной среде, приготовленной на обычной дистиллированной воде, исходное значение рН которой 8,3 получено при помощи 0,3 мМ1 ис -НС1-буфера (состав инкубационной среды:

Оь2 мМ АТФэ 0 ° 2 мМ MgS04 7HgO, 0,3 мМ трис -HC, стрелкой обозначен момент добавления взвеси митохондрий, приготовленной на 0,25 М сахарозе, AB — линейный участок записи) .

На фиг.4 показана кинетическая запись активности Н -АТФ-азы митохондрий мозга крыс в беэбуферной инкубационной среде баз ингибитора (состав среды и условия инкубации те же, что и для фиг.1) .

На фиг.5 показана кинетическая запись активности Н -АТФ-азы митохондрий мозга в безбуферной инкубационной среде в присутствии 5 мкг олигомицина (состав среды .и условия, инкубации те же, что и в эксперимен-, те, представленном на фиг.!).

Применение предлагаемого способа; сделало возможным приготовление инкубационной среды.с заданным значением рН.без внесения дополнительных реактивов (буфер, кислоты, щелочи), способных влиять на ионную силу среды и изменять характер ионизация актив ного центра фермента. Данный способ позволяет получить инкубационную среду с постоянным ионным составом, тогда как при использовании буфер12

1133534

Фиг. 2 ных растворов конечная концентрация ионов, которая образуется при доведении рН среды до нужных значений, всегда различна. Это имеет значение для определения активности некоторых катиончувствительных ферментов (например, К, Na -АТФ-аэы).

Исключение буфера из инкубационной среды позволяет получить гораздо более выраженный сдвиг. рН в ходе ферментативных реакций, что резко повышает чувствительность метода.

Так,при проведении экспериментов по определению активности Н+-АТФ-азы, по стандартной прописи инкубационной среды регистрировался очень большой сдвиг рН вЂ” от 0,5 до 0,7 единиц в течение обычного времени инкубации.

Это позволило пропорциональна уменьшить концентрации всех компонентов реакции до 10 раз по сравнению с известным способом. Кроме того, по сравнению с известными буферными методами предлагаемый способ обеспечивает линейность записи начальной

10 скорости ферментативной реакции практически на всей ширине ленты самописца. Это существенно облегчает обсчет кривых, характеризующих изменения рН, и повышает точность вычис15 ления кинетических параметров реакции (V Ч„,о, К, К и т.д.) .

1133534

1133534

Составитель О. Скородумова

Редактор А. Шишкина Техред Т. Фанта Корректор В. Синицкая

Заказ 9944/37- Тираж 898 Подписное

ВНИИПК Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

»3О35, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4