Штамм @ @ ( @ ) n71 и способ получения ларвицидного препарата на его основе

 

1. Штамм Bacillus thuringiensis (Н № 71 (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицидного токсина 2. Способ получения ларвицидного препарата на основе штамма Bacillus churingiensis, включающий ег,о глубинное культивирование и-высушивание культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют Bacillus thuringiensis (Н №71, сл который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость концентрируют путем сепарирования, к концентрату добавляют хлористый натрий в количестве 35-40% к содержанию С сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают пу;гем распыпительной сушки. 00 ел .0 к 4

COOS СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСН0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ ЙОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3575852/30-15 (22) 06.04.83 (46) 30.04.87. Бюл. ¹- 16 (7 1)Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) Н.В.Кандыбин, Н.М.Барбашова, В.П.Ермолова, О.В.Смирнов, Г.Е.Скворцов, А.И.Пахтуев, P.Ï.Êîìàðñêèõ, В.И.Бессонов, О.В.Викторов-Набоков и Н.Д.Михновская (53) 614.449(088,8) (56) Кандыбин Н.В. и др.. Бактокулицид — эффективное биологическое средство борьбы с комарами. В кн,: Современные направления медицинской резинсекции и дератизации. Тез.докл.

М., 1981, с. 63-64.

Авторское свидетельство СССР

¹ 378408, кл. А 01 N 63/00 (прототип) „,SU„„1135024 (51)4 А 01 N 63 00 (54) ITAMN BACILLUS THURINGIENSIS (Н 4) № 71 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАРВИ,ЦИДНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ (57) 1. Штамм Bacillus thuringiensis (Н 4) № 7 1 (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицидного токсина.

2. Способ получения ларвицидного препарата на основе штамма Bacillus

thuringiensis, включающий его глубинное культивирование и высушивание культуральной жидкости, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют Bacillus thuringiensis (Н„) -71, который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость концентрируют путем сепарирования, (® к концентрату добавляют хлористый натИ рий в количестве 35-407 к содержанию сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают путем распыли,тельной сушки.

1 11350

Изобретение относится к микробиологическим средствам борьбы с кровососущими комарами и представляет со.бой новый штамм Bacillus thuringiensis 14-го серотипа (н11), предназначенный для изготовления бактериального препарата бактокулицида, и способу получения такого препарата.

Известен штамм Bacillus thuringiensis (Н ) 266/2 из коллекции ССЕВ 10 (ЧССР).

Этот штамм не обладает стабильностью и при хранении диссоциирует с образованием гладких и шероховатых вариантов с пониженной продуктивностью, 15 причем гладкие варианты полностью лишены вирулентности, а также спонтанно продуцируют вирулентный фаг в культуре.

Известен также ряд способов произ- 20 водства энтомопатогенных препаратов на основе Bacillus thuringiensis

Так, например, известен способ производства препарата энтобактерина путем глубинного выращивания продуцента в течение 30-35 ч на жидкой питательной среде с аэрацией при 29-31 С с высушиванием микробной массы вместе с культуральной жидкостью при 115—

11 8 С и последующей стандартизации 30 препарата путем добавления наполнителя.

Однако указанный способ не позволяет получать препарат с титром выше

30-40 млрд. спор в 1 кг. 35

Цель изобретения — повышение выхода и вирулентности препарата на основе Bacillus thuringiensis.

Для достижения цели предлагаются штамм Bacillus thuringiensis (Н„) У 71 40 (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицндного токсина, и способ получения ларвицидного препарата на основе Bacillus thuringiensis, включающий глубин- 45 ное культивирование бактерий и высушивание культуральной жидкости, отличающийся тем, что с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют

Васillus thuringiensis (Н„) N - 71, который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость концентрируют путем сепарирования, к концентрату добавляют хлористый нат- 55 рий в количестве 35-40Х к содержанию сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают путем распылительной сушки.

24 2

Штамм (Ii) N - 71 представляет собой

1 грамположительные палочки активно подвижные, длина 2,9-3,8, ширина 0,91,1 мкм, споруляция начинается через

36-48 ч, При этом образуются субтерминальные споры эллиптической формы диаметром 0,9-1,1 мкм и параспоральные включения неправильной формы и неодинаковые по размеру:. 0,5 х 0,4

1,4 х 1,2 мкм.

Культурально-физиологические признаки.

На мясо-пептонном arape (МПА) через 5 сут инкубации при .26 С образует средней величины колонии диаметром 1,2-1,8 см, с волнистым слегка опущенным краем, матовой мелкошероховатой поверхностью по краям и блестящей к центру колонии.

Цвет серовато-бежевый или с розоватым оттенком. Посев штрихом. Через

5 сут инкубации при 26 С íà MIIA культура растет обильно, край мелкозубчатый, неровный, поверхность матовая, в центре штриха — мелкошероховатая, консистенция вязкая. Окраска питательной среды не меняется.

Посев уколом. Рост по уколу на

ИПА корневидный по всей длине и поверхности.

На мясо-пептонном бульоне (ИПБ) через сутки инкубации при 26 С образует поверхностную пленку и помутнение среды, на 5-е сутки — осадок белого цвета.

Отношение к углеводам. Сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, глицерин, крахмал, маннозу, трегалоэу. Не сбраживает сахарозу, лактозу, арабинозу, ксилоэу, галактозу, рамнозу, рафинозу, левулезу, сорбит, дульцит, маннит, салицин, Гидролизует крахмал, разжижает желатину, молоко пептонизирует.

Антигенные свойства — относится к H« — серотипу.

Антагонистические свойства — не проявлялись по отношению к культурам

Bacillus thuringiensis других серотипов (Н„ Н ).

Патогенные свойства.

Обладает высокой токсичностью для личинок комаров.

Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно-высушенной культуры в стерильных запаянных ампулах прн 4

6 С или в кристаллах хлористого нат1135024 в обыч3 рия в стерильных пробирках ных условиях, Производственные показатели штамма — прототипа и предлагаемого штамма сранивались при выращивании их глубинным методом.на дрожжеполисахаридной среде.

Данные приведены в табл. 1 и 2.

Продуктивность штаммов (млрд, спор/мл культ. жидкости). 10

Как показывает таблица, предлагаемый штамм 71 в 3 с лишним раза про дуктивнее штамма-прототипа 266/2, Титр спор и кристаллов.в готовом продукте, полученном на основе пред- 15 ложенного и применявшегося ранее штаммов, приведен в табл. 2, Как показывает таблица, использование предлагаемого штамма позволяет получить препарат, в котором титр 20 спор выше, чем в случае использования штамма — прототипа почти в 3 раза, Определение ларвицидной активности готовых препаратов, полученных

1) с использованием штамма-прототипа и 2) с использованием предложенных штамма и способа получения препарата на его основе, показало, что в пер-. вом случае доза ЛК для личинок 4-ro возраста комара Aedes aegypti соста- 30 вила 0,29 мг/л, а во втором — 0,12 мг/л, .и следовательно, изобретение дает воэможность повысить ларвицидную активность препарата в 2,5 раза.

Пример осуществления изобретения.

Штамм (Н„) 71 выращивают в пробирках поверхностным методом на МПА в течение 7 сут при 28 С.

Полученную культуру используют для засева колб с жидкой питательной сре-40 дой следующего состава, 7: дрожжи сухие кормовые 2,0; мука кукурузная

1,5; вода водопроводная остальноь рН среды 7,0-7,2. Культуру в колбах выращивают на качалке (200-280 об/мин 5 в течение 72 ч при 28-30 С до польбго спорообразования и используют ее в качестве посевного материала.

Для получения ларвицидного препарата культуру выращивают глубинным g0 методом на ферментационной среде состава, Ж:

Дрожжи сухие кормовые 2,0

Мука кукурузная 1,5

Вода водопроводная Остальное рН среды 7,0-7,2

Культивирование осуществляют при

28-30 С при постоянном перемешивании и аэрации среды. Длительность ферментации 35-40. ч, После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую опоры и кристаллы эндотоксина Bacillus thuringiensis (Н„ ), а,также остатки пи- . тательной среды подвергают концентрированию методом сепарирования..К полученному концентрату культуральной жидкости перед высушиванием добавляют хлористый натрий в количестве 35-40Х (в расчете на содержание сухих веществ в концентрированной культуральной жидкости) и высушивают в распылительной сушильной установке при следующих условиях: температура сушильного агента на входе в сушильную башню 130-140, на выходе

70-75 С.

Полученный сухой продукт, содержащий .споры и кристаллы эндотоксина

Васillus thuringiensis (Н„, используют в качестве ларвицидного средства для борьбы с кровососущими комарами, Полученный препарат имеет следующий состав, мас.X:

Спорокристаллический комплекс 15-16

Остатки питательной среды 45-49

Наполнитель (хлористыи натрий) 35-40

Использование предлагаемого высокопродуктивного штамма Bacillus thuringiensis 71 и способа получения на его основе препарата, в особенности введения хорошо растворимого в воде наполнителя (хлористый натрий), позволяет получить после высушивания мелкодисперсный хорошо растворимый высококонцентрированный порошок бактокулицида, превосходящий по свонм показателям, как было показано ранее, известные препараты в 2,5-3 раза .

1135024

Таблица 1

Номер штаммапродуцента

Средняя

Достоверность разницы 2-х вариантов

Ошибка средней

d" разность средних

,-Ч,- П Э

ma

266/2 (ССЕВ) 0,87;0,81; 0,82

0,78

0,045

71 (ВНИИСХМ) 2,85;2,78;

2,56;2,82

1,91

О, 115

16,61

2,72;2,68 2,73

О, 106

Таблица2

Титр спор и кристаллов в готовом продукте (млрд/л) Достоверность разницы 2-х вариантов

Номер штаммапродуцента

СредняяОшибка у средней ду ошибка разности

mD разность средних

g-y- =D

D м

266/2 (ССЕВ) 25,0

34,8

33,1 8,10

55 0

1, 109

61,1

39,4

Различия, 7 1 (ВНИИСХМ) 106, 0

97,5 88,5 94,2 7,57

89,0 89,8

Редактор Л.Письман

КорректоР М.йароши

Техред И.Попович

Тираж 630

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 1648/3

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðîä, ул,Проектная, 4

Значения вариант - („

Значения вариант (,- ч. ошибка разности m-П

Различия достовер ны при

P = 0,95 достовер- ны при

P = 0,95