Штамм @ @ 94/77-продуцент протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного действия

 

Штамм Hypomyces rosellus 97/77 (Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер F 242) - продуцент протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного действия. (Л

СООЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

PECflVSfIHH. С 12 N 15(00, 9/48, ф !2 !! !5/00 С

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

М АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4"АЗОТЕ", ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3627898/28-13 (22) 22.07.83 (46) 30.08.85. Бюл. 1! 32 (72) Е.Г.Торопова, Н.С.Егоров, И.И.Сидорова, Г.Г.Береснева и Н.Ф,Пискункова (71) МГУ им.М.В.Ломоносова . (53) 577. 15(088.8). (56) 1. Овчаров А.К., Негру-Воде В.В.

Термофильный актиномицет Micromonospora vulparis 42 — активный продуцент протеолитических ферментов.

Ферменты микроорганизмов, 1973, с. 92-100..

2. Авторское свидетельство СССР

N - 670137, кл. С 12 N 9/00, 1977 °

„„SU„„1135189 A. (54) ШТАММ НУРОМУСЕБ ROSEI.I.US 94/77—

ПРОДУЦЕ1!Т ПРОТЕАЗНОГО КОМПЛЕКСА И . ПРЕПАРАТА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО И ФУНГИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ. (57) Штамм Hypomyces rosellus 97/77 (Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института

"ВНИИгенетика™, коллекционный номер

ЦМПМ F 242) — продуцент протеаэного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного действия.

1135189

Изобретение относится к микробиологическому производству протеолитических препаратов и препаратов, обладающих антибактериальным и фунгицидным действием, и представляет собой новый штамм микрофильных грибов рода

Нурошусеа.

Изобретение може быть применено в микробиологической,промьппленности сельском хозяйстве и фитопатологии. 10

В настоящее время известны штаммы грибов, бактерий, актиномицетовпродуцентов протеолитических ферментов.

Известен штамм. актиномицетов — 15 продуцент протеолитических ферментов, например TepMQAHJIbHbIA актиномицет

Micromonospora vulgaris 1 .

Недостатками этого штамма являются низкая активность протеолитических 20 ферментов в купьтуральной жидкости продуцентов; невысокая казеинолитическая активность в препаратах; образует только один полезный целевой продукт — протеазу и не образуют 25 препарат, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием, Наиболее близкими к предлагаемому, по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются ЗО штаммы Dactylium dendroides u Nono sporium aparicinum (2$.

Недостатками этих штаммов являются низкая казеинолитическая активность протеаз в культуральной жидкости; образуют препарат, обладающий только фунгицидным действием, Цель изобретения — получение штамма микофильного гриба Hypomyces

rosellus 94/77, продуцирующего про- 4р теолитические ферменты с высокой казеинолитической активностью и препарат, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием.

11тамм Hypomyces rosellus 94/77 хранится в музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦИПМ Р 242.

Предлагаемый штамм Hypomyces

rose11us 94/77 выделен путем моно- 50 спорового рассева из налета гриба на плодовом теле Cystoderma amianthinum

9.9.1977 r. собранном в заказнике

Звенигородской биостанции МГУ (Московская область, Одинцовский район). 55

Идентификацию предлагаемого штамма прьводили, используя соответствующие источники литературы (Арнольд Г,Р.

Предварительный обзор микофильных грибов СССР. Новости. систематики низших растений, 7, 108-120, 1970;

Cams W., Hoozemans А.S. "Cladobotryum-konidien formen von Hypomycesarten",Ðersoonia, 6, 95-100, 1970).

Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками. .Морфологические признаки.

Конидиеносцы прямые, разветвленные. Конидиогенные клетки ампуловидные, расположены в мутовках по

3-6, 30-50 х 4-6 мкм, гиалиновые.

Конидии холобластические, образующиеся в результате последовательной симподиальной пролиферации вершины конидиогенной клетки (симподулоконидии), одноклеточные, позднее с

1-3 поперечными перегородками, овальные или цилиндрические, с закругленными концами, у основания час-.

То с небольшим сосочком, 24-32 х 913,5 мкм. Хламидоспоры обильные, округлые, коричневые.

В парных культурах с совместными штаммами образуют сумчатую стадию, Субикулюм распростертый, сначала белый, позднее карминовый, плотный, Перитеции тесно скученные или разбросанные, сначала погруженные в субикулюм, позднее поверхностные, почти свободные, грушевидные с конусовидным носиком, .красноватые, 320-350 х 280-400 мкм. Сумки цилиндрические, унитуникатные, 170-200 х х 6-8 мкм. Аскоспоры веретеновидные, двуклеточные, с перетяжкой, на концах с длинными придатками, бородавчатые, бесцветные, 28-40 х 6,57,5 мкм.

Культуральные признаки.

Среда Чапека с сахарозой. Колонии широко растущие, очень рыхлые, сначала белые, затем местами розовые или желтоватые. Спороношение необильное. Среда окрашена в бледно-розовый цвет.

Среда Чапека с 0,5Х кукурузного экстракта. Колонии широко растущие, пушистые, сначала белые, быстро приобретающие розово-малиновую окраску с коричневато-желтыми участками. Спороношение обильное, в виде белого порошистого налета по всей поверхности колонии. Обратная сторона колонии и среда темно-красные с желтовато-коричневыми участками.

1135189

3

Сусло-агар. Колонии широко расту щие, рыхлые, пушистые, с неровным краем, сначала белые, затем коричнево-желтые с обильными малиновыми участками, затем малиновые. Спороношение обильное, в виде белого порошистого налета по всей поверхности колонии. Обратная сторона колонии и среда карминно-красные до темнопурпурных.

При глубинном культивировании из минеральных и органических средах штамм растет в виде гомогенной массы или мелких шариков. Мицелий окрашен в карминно-красный цвет, культураль- 15 ная жидкость имеет коричнево-красную окраску..

Физиолого-биохимические признаки, Хороший рост штамма наблюдается при температуре 15-25 С, слабыи 20 рост при температуре 5-10 С и 30 С.

При температуре 0 и 35 С рост отсутствует.

При росте на среде Чапека (основ25 ной сблевой состав) усваивает нитраты калия и аммония, винно-кислый аммо вЂ, ний, мочевину, пептон, гидролизат казеина, соевую муку, глюкозу, сахарозу, ксилозу, глицерин, маннит. Гидролизует крахмал и в очень слабой степени целлюлозу.

Чувствителен к антибиотикам трихотецину и циклогексимиду.

Патогенностью не обладает.

Предлагаемый штамм синтезирует 35 внеклеточные протеолитические ферменты с высоким казеинолитическим и фибринолитическим действием и препарят, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием. 40

Высокая активность штамма относительно стабильна при длительном (1 од-полтора года) хранении его на агаризованном сусле (4 по Баллингу) в пробирках под вазелиновым маслом 45 при комнатной температуре (18-24 C).

Пример. Штамм Нурошусея гояе1lus 94/77 выращивают в пробирках на известной агаризованной среде (4 по

Баллингу сусло, рН 6,0) в течение 50

5 сут при температуре 24 С. Затем о мицелий гриба петлей иэ пробирки вносят в известную жидкую питательную среду, .содержащую 4 по Баллингу сусло с рН 6;0 ° Посевной материал ss выращивают на качалке (200-220 об/мин) в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды в течение 48 ч при 24-26 С.

Затем посевной материал в количестве 7Х по объему вносят в среду следующего состава, 7: соевая мука

2,5; сахароза 2,0; вода водопровод ная, рН 6 ° 2 и выращивают тем же способом в течение 3 сут при 26 С.

Культуральную жидкость отделяют от мицелия при помощи бумажных фильтров.

Сравнительные данные протеолитической активности культуральной жидкости и soíà подавления роста тесторганизмов культуральной жидкостью предлагаемого штамма и прототипа представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, протеолитическая активность предлагаемого штамма в 1,5-2 раза выше, чем у известных штаммов. Кроме того, предлагаемый штамм образует препарат>обладающий способностью подавлять рост фитопатогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, в отличие от известных штаммов, образующих препарат только фунгицидного действия.

Из культуральной жидкости предлагаемого штамма путем осаждения сернокислым аммонием при насыщении 0,60,7 при рН 7,0-8,0 выделяют протеолитический комплекс.

Субстратная специфичность протеолитического комплекса Hypomyces

rosellus 94/77 представлена в табл, 2.

Фибринолитическая активность протеазного комплекса, определенная по методу Аструпа и Мюллертца (Astrup T., Мй11егсу S. "The estimation of. plasmin and trypsin by

means of the plate method". Acta .physiologiua Soand. V. 25, р. 93, 1952), составляла 7200-7750 усл,ед/мл.

Температурный оптимум препарата

50 С ° Препарат сохранял свою исход- .. о ную активность при 4 С в течение

3 месяцев.

Препарат, подавляющий рост некоторых фитопатогенных грибов и грамотрицательных и грамположительных бактерий, экстрагируется иэ фильтрата культуральной жидкости хлороформом (1:1) при рН 5,0. Полученный экстракт дважды фильтруется через бумажные фильтры и обрабатывается петролейным эфиром в соотношении (1:15), Препарат, перешедший в петролейный

1135189 эфир, высушивается, осадок растворя ется в этиловом спирте.

Т а б л и ц а

Протеолитическая Зона подавления активность, роста тест-оргакаэ.ед/мл низмов, мм ч

Штамм микроорганизмов

1 2 3

3,74

5,74-6 5

25 25

20 н/ Определяли по методу Сгоурис (Sgousis J.Т. Vuman J.Ê. Месаll Х.В. . The evalution of fibrino1ytio preparation. Vox. Sanguinis, ч. 6, р. 53, 1961) . нн/ Определяли методом диффузии в агар (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. "Высшая школа", 1965); тест-организмы: 1 — Bacillus Subtilis; 2 — Helmyntosporium sativum; 3 — Escherichià «oli.

1 Таблица 2 н/ Протеолитическая активность ПЕ/мл

Субстрат протеолитический комплекс культуральная жидкость

Казеин

600-700

Гемоглобин

Бычий альбумин

Плазма крови н/ Определяли по методу Ансона в модификации Каверзневой (Каверзнева Е.Д.

Стандартный .метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз. Прикл. биохим, и микроб., т. 7, в. 2, ° 225-228, 1971) °

Редактор С. Титова Техред Ж.Кастелевич

Корректор И. Эрдейи

Заказ 5773/4

Подписное

Тираж 525

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r . Ужгород, ул. Проектная, 4

Полученный препарат обладает анти- бактериальйым и фунгицидньвк действием, подавляет рост следующих тест-организмов: Staphylococcus sureus, Escheric-.

Ma coli, Pseudomonas fluorescens, Вас111ив subtilis, На1шуп1оэротиьш 10

sativum.

Dactylium dendroides-6 (известный штамм)

Monosporium agaricinum-287 (известный штамм)

Hypomyces гоэе11пэ - 94/77, (предлагаемый штамм) 4000-4500

460-960

500-770

140-180 .

Использование предлагаемого штамма по .сравнению с известными имеет следующие преимущества: высокая, казеинолитическая активность протеолитического комплекса и протеаэ в культуральной жидкости; образует препарат, подавляющий рост фитопатогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий.