Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ (его варианты)

 

1. Биоспецифический полимерНьй адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель. связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного -носителя, связанного с ингибитором , сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хпорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или N-винилпирролидона и бифункционального схци ающего агента , взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.%, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.%, вода - остальное. 2. Биоспецифйческий полимерный адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный С белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повьшения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с СО ингибитором, сшитый сополимер ofib мукоида из белка утиных яиц, ацилиоо , рованного хлорангидридом ненасыщен00 00 ной кислоты, акриламида, или метакриламида , или N-виниапирролидона и бифункционального сшивающего агента , взятых соответственно в количествах; 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041 ,40 мае. %, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414 ,1 мае. %, вода остальное.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИН 4 (51

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3427499/28-13; 3427601/28-13 (22) 15.04.82 (46) 30.01.85. Бюл. ¹ 4 (72) Н.А.Платэ, Л.И.Валуев, И.А.Маклакова, В.В.Чупов, Т.А.Валуева, В.B.Мосолов, В.Г.Акопян, В.Т.Кондаков и В.В.Щербачев (71) МГУ им. М.В.Ломоносова, Институт биохимии им. A.Н.Баха и Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (53) 577.15(088;8) (56) 1. Liepnieks ?.J., Light А.

Preparation of P-Trypsin by А1:йinity Chromatography of Entегоkinose—

Activa .:4 Bovinå Trypsinigen.—

"Апа1усЬ aI Biochemistry" 1974, ч. 60, р. 395-404,.

2. GiIliam Е.В., Kitto G.Â.

Isolation of starfish trypsin by аЕКinity chromatography. — "Сошрагаtive Biochemistry and Physiology", 1976, v. 54, р. 21-26.

3. Иульгин N.H., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом афинной хроматографии на трипсич-сефарозе. — "Биохимия", т. 46, № 3, с. 473-480. ! (54) БИОСПЕЦИФИЧЕСКИИ ПОЛИМЕРНЫЙ

АДСОРБЕНТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ (КГО ВАРИАНТЫ) . (57) i. Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, „.Я0„, 1137388 А связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью новышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного .носителя, связанного с ингибитором, сшитый сополимер овомукоиpà из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакрил-амида, или М-винилпирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.Х> при содержании указанного сополимера в адсорбенте ф

4,2-13,0 мас.Ж, вода — остайьное.

2. Биоспецифйческий полимерный

Ф адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым инги битором протеиназ,. и воду, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с ингнбитором, сшитый сополимер DA)мукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакриламнда, или К-виниднирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041,40 иас. Ж, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414, 1 мас. Ж, вода — остальное.

1137388

Изобретение относится к химии полимеров и биохимии, а именно к биоспецифическому полимерному адсор-, бенту для выделения протеиназ из биологических жидкостей, и может быть использовано для получения высокоочищенных препаратов протеиназ, а также для очистки биологических жидкостей от этих ферментов. Последнее необходимо для предотвращения ферментативного разрушения белковых веществ в процессе их выделения из объектов животного происхождения.

Для выделения протеиназ из биологических жипкостей известны биоспе/ цифические адсорбенты, содержащие полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду и получаемые активацией полимерного носителя - 20 сшитого полисахарида (сефарозы) бромцианом с последующим ковалентным присоединением к активированной сефарозе белкового ингибитора протеиназ (1 ).

Для этого к набухшей в воде сефарозе, содержащей 4-6Х твердого . полимера, при рН 11,0 добавляют бромциан. Полученную суспензию перемешивают в течение 8 мин, поддержи- 30 вая рН равным 10,8-1 1,2 добавлением

5 М раствора гидроокиси натрия. 3атем активированную сефарозу промывают водой и бикарбонатным буфером (pH = 9,5), и к ней добавляют раствор ингибитора. Суспензию перемеши-. вают 18 ч при 4 С, многократно промывают буферными растворами с рН

2,2 и 8,0 и непрореагировавшие группы активированной сефарозы нейтрали- 40 зуют раствором глицина.

Известен биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ из биологических жидкостей, 45 содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.

В качестве полимерного носителя, концентрация Которого в адсорбенте 50 составляет 4 мас., адсорбент со;держит сшитый полисахарид сефарозу, а в качестве белкового ингибитора протеиназ — ингибитор трипсина из . сои. Концентрация ингибитора сос- 55 тавляет 25 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать трипсин в количестве 5 мг/мп адсорбента 23.

Недостатками этого адсор бе нта являются невысокая эффективность адсорбента, составляющая 0,2 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств адсорбента, который в качестве полимерного носителя содержит способный разрушаться под действием ферментов полисахарид — сефарозу, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Последнее не позволяет использовать адсорбент для извлечения протеиназ из крови. Кровь при контакте с таким адсорбентом свертывается в течение

5-6 мин.

Наиболее близким к изобретению является биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.

В качестве полимерного носителя, концентрация которого в адсорбенте составляет 4-6 мас.Х, адсорбент содержит сшитый полисахарид — сефарозу,а в качестве белкового ингибитора npof теиназ — ингибитор трипсина из лимской фасоли, Концентрация ингибитора составляет 5,4 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать

1,6 мг трипсина/мл адсорбента (3 ).

Недостатками этого адсорбента являются невысокая эффективность адсорбента по протеиназам, составляющая 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств ацсорбента, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Время свертывания крови при контакте с таким адсорбентом составляет 5-6 мин.

Целью изобретения является повышение емкости адсорбента по протеиназам.

Поставленная цель достигается тем, что биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, в качестве колимерного носителя, связанного с ингибитором, содержит сшитый сополимер .овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или -винилпирроли3 1 дона и биофункционального смешивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80

90,60 и 8,60-15 60 мас. 7 при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.Х, водаостальное.

137388 нице между исходной концентрацией этих веществ н их концентрацией в промывных водах. Содержание полимера в адсорбенте определяют высушиванием адсорбента в вакууме при ком натной температуре до постоянного

;веса.

Кроме того, в качестве полимерного носителя, связанного с ингибито- 1р ром, адсорбент содержит сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакрнламида, или И-винилпирролидона и бифункционального сшиваю- щего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30i. 55,2090,55, 8,60-41,40 мас. 7 при содержании указанного сополимера в . адсорбенте 3,4-14, 1 мас.Ж, вода— остальное.

Используемый овомукоид является гликопротеином с мол. массой около

22000. Его выделяют из белка утиных яиц по методике (3 3. Гепарин является мукополисахаридом, который применяют для предотвращения свертывания крови.

Биоспецифический адсорбент получа-ЗО ют раздельным ацилированием овомукоида и гепарина хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 6,0-8.0, температуре 0-30 С и мольным отношении овомукоид (гепа- 35 рин):хлорангидрид равном 1:10-100.

Затем полученные растворы смешивают и к ним добавляют акриламид, иетакриламид или N-винилпирролидон в количестве 7-20 мас. Х, бифункцио- 40 нальный сшиванщий агент, например

N,N -метипенбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты, в количестве

0,7-15 мас. Х и инициатор радикальной полимеризации. Полученный раст- 45 вор вакуумируют или продувают инертным газом для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием раствора при О20 С в течение 10-20 мин. Получен- 50

D ный продукт измельчают до частиц- с размерами О, 1-1,0 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН 8,0 до полного удаления непрореагировавших соединений. Полноту удаления контро- 55 лируют спектрофотометрически..Количество связанного с полимером гепарина и овомукоида определяют по разЛля выделения протеиназ из биологических жидкостей адсорбент помещают в колонку объемом IO-50 мл, и через колонку пропускают жидкость. Количество адсорбированного фермента определяют по разнице между его исходной концентрацией в жидкости и конечной концентрацией или путем элюции адсорбированного фермента буферным раствором с рН 1,52,0. Промывание адсорбента указанным буфером обеспечивает полную элюцию фермента и многократное использование адсорбента. Гемосовместимость адсорбента оценивают по времени образования фибринового сгустка (тромбиновое время) при реакции фибриногена с тромбином в присутствии адсорбента или путем измерения времени свертывания крови при ее контакте. с адсорбентом.

Пример 1. В 80 мл бикароонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 100 мг овомукоида из белка утиных яиц. К раствору при 0 С добавляют 0,01 мл хлорангидрида акриловой кислоты, Реакционную смесь перемешивают при О С в течение 15 мин.

В 20 мп бикарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 20 мг гепарина, к раствору добавляют 0,003 мл хлорангидрида акриловой кислоты.

Раствор перемешивают при 4 С в течение 15 мин. Оба раствора смешивают и к ним добавляют 10 r акриламнда с

Э 1,0 г N,N -метиленбисакриламида и инициатор полимеризации — 0,01 r персульфата аммония и 0,2 мл

4X Horo pacTsopa N,N,N,N тетра метилэтилендиамина. Через раствор в течение 10 мин пропускают аргон для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 10 С в течение 20 мин. После окончания полимериэации адсорбент, который представляет собой хорошо набухающий в воде полимерный гидрогель, измельчают и промывают бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений.

1137388

Свойства адсорбента приведены в табл. 1. Аналогичным образом получают адсорбент без гепарина, Свойства этого адсорбента также приведены в таблице. 5

П р и м.е р ы 2-4. Процесс получения адссрбента проводят по примеру 1, используя различные мономеры и сшивающие агенты. Состав исходной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 1.

П р имер 5. В 10 мп бнкарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 10 мг овомукоида из утиных яиц, К раствору при О С добавляют 15

0,001 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Реакционную смесь перемешивают при 0 С 15 мин. Затем к полученному раствору добавляют 1,0 г акриламида, О, 1 г N,N — метиленбисак- 20 риламида и инициатор полимеризации—

0,01 г персульфата аммония и 0,1 мл

0,47-ного раствора N,N,N И -тетра( метиленэтилендиамина. Через раствор в течение 5 мин пропускают аргон. 2Б о

Полимеризацию проводят прн 15 С в течение 10 мин. После окончания полимеризации адсорбент измельчают и промывают бикарбонатным буфером (рН = 8,0). Свойства адсорбента при- 3О ведены в табл, 2.

Пример ы 6-10. Процесс получения адсорбента проводят по примеру 5, используя различные мономеры и сшивающие аге:--ты. Состав исход- З ной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 2.

В табл. 1 и 2 приняты следующие обозначения: ХААК вЂ” овомукоид,ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, ХАКК вЂ” овомукоид, ацилированный хлорангидридом метакриловой кислоты, AA — акриламид, ВП вЂ” N-винилпирролидон, MAA — метакриламид, БИС вЂ” N,N — метиленбисакриламид, ТГИ-13 — диэфир метакриловой кислоты и полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 13.

Таким образом, предлагаемый адсорбент обладает повышенной эффективностью. Так, емкость адсорбентапрототипа, который одновременно является базовым объектом, составляет 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора. Емкость адсорбента по изобретению составляет

0,8-1,0 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, т.е. этот адсорбент является в 3-4 раза более эффективным, чем адсорбент-прототип.

Повышенная эффективность адсорбента позволяет в 3-4 раза сократить расход наиболее дорогостоящего компонента адсорбента — белкового ингибитора протеиназ. Использование в качестве полимерного носителя синтетического полимера карбоцепного строения на основе легко доступных мономеров, кроме того повышает устойчивость адсорбента к деградации под действием кислот, щелочей и различных ферментных систем по сравнению с адсорбентом-прототипом, который является полисахаридом и содержит в основной цепи легко гидролизуемые связи углерод-кислород. Состав адсорбента, а следовательно, и набухаемость адсорбента, можно легко регулировать путем изменения состава исходной реакционной смеси. Изобретение характеризуется также доступностью и простотой выделения овомукоида из белка утиных яиц.

1137388

Ю

<4 ь

+I

Ю +I

ОО

СЧ о

+ o

С 1

+I ь

С5, С»

o z о Г

1 о

1 х х о о, о

О 1х х х ю

<б Х 1

1»

Я х

1»

Х

0)

Я1 ,Я

Ю л 0 а)

E» E

v x о е х ю

& х

1 х (U ф.

Ю =К

СО С»! М л л л

СЧ М М ф 1»

Ю и л

С»! ф

М

СЧ л

О1 л о

Е» о о о, о

СО

М л х

I х

I а

Е х

Ю Ь л л 1

ОО со 1

».

1

1 о л

М л,о о

cd

)»»

А х

1 о

Р с о » х х х

1» о о

I х

И

Г

С; х

Х !»

О Е

I о

М л

С4 л

Ю л

Ю»

Ж М

EQ I

»

1 I

Ю = С С

» I с»1 (Э ж

1 14

С4 о х

E о ф

С л

С4

Ф

X о х о

С0

Ю ! С 1

Ю

Ю

Г».И. И

;3. Я о

Ф

Е о

C х

tf 1 о

Х 1

u -!

Ж I

Ю а О г lA

С 4 С 4

Ю Ь Ю СО CO л л л

»» о о

Ch л о С»! л СЧ л л л

Ю С Ю o o o о

Д»

Г4 <б о е о

I Х Ц

Х (U

1 о

1-ХО

I Ю I:4 са о х

С4 V о

mx9

I E» Kl m о о

1 3 Х 5

1 и Х Х

1 йВЬ р, д о. ооо

Zu™Qv ! Ф

1137388

10 о с

1 ф !

0 !» О оахх

Х 1- Х

Ю Х Ф cd cd х Ф е» ю

I-ЮХО8

ХОФФ&

Фоххх

gu О,qc0

Fl 5 & c0 !»

)1

I

1 !

О ф

I !

- о л

1 х

Ф Ф ф ф 1< Яс

Ю л м

& 1-1

Ф Ф

О Е В; л

Ш E E

3х х Ф3 о х м

1 cd I.Ý Ф

E I I E хФ ц О

1о! оо

О 1 t» Х

О !

О

Ф

1» Ц

1 1 Х а о

О 1 О

1 В

1 Ю

I Е

I Х

1 Ф

1 С»

1 Ф

cd

С4 о

Е

& Ж о

И1ф

v v ж ж

Kl FCI о ц ж ж

FCI Kl о о о

v 1

Ь вЂ” — — — »

g!

X ь

С

Г-ю л

А о

1 о

1 К

I Х о о

I й

1 О

X о

Ф х и о

Х

4 о л л о оо о oo oo л л л о — о о

I 1с 4с

4С М 31 о о л r- м л л л о сч an м>

Г1 Г1 м iM !. о

Ф 00

4О Ч С а л л л л л л о сч л м и л л 1Г л о сч»»» о î о

Cl л л л о о

СЧ СМ и о а в л л л л о

1 а О I

1

I о л

II о о х х х о, Й х х х йиi

О. Р. g4 о о о ф 31