Штамм базидиального гриба coprinus dомеsтiсus (fr)gray вкм f 2459 д - продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов.

Авторы патента:

C12R1/645 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12N9/50C12N15 - Ферменты, например лигазы (6.); проферменты; композиции их (препараты для чистки зубов, содержащие ферменты A61K 7/28; лекарственные препараты, содержащие ферменты или проферменты A61K 38/43; составы моющих средств, содержащих ферменты C11D); способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов (приготовление солода C12C 1/00)

C12N15 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Штамм базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gtay (Всесоюзная коллекция микроорганизмов ИБФМ АН СССР, коллекционный номер BKMf 2459 Д) - продуцент фибринолитических и .тромболитических ферментов. (Л со vj СП) tsD тов патогенных микроорганизмов (м/о) из рода Streptococcus и непатогенных м/о, например плесневых грибов р. Aspergillus и др. Однако использование как патогенной , так и непатогенной микрофлоры имеет серьезный недостаток, связанный с природой эТих организмов они спороносят в культуре, что способствует профессиональным и аллср

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECllVB JlHH

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21), 3642122/13 (22) 29.07.83 (46) 07.08.91. Бюл. ¹ 29 (71) Ботанический институт .им. В.Л.Комарова и 1-й Ленинградский медицинский институт им. акад.

И.П.Павлова (72) Н.П.Денисова, Н.В.Псурцева, Н.Н.Фалика, Н.Н.Петрищев и В.И.Княнов (53) 577.15(088.8) (56) Хайдарова Н.В., Егоров Н.С. Фибринолитические ферменты микроорганизмов. В кн.: Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции. M., 198 1, с. 155-166.

Авторское свидетельство СССР № 907070, кл. С 12 N 9/50, 1980.

Патент Великобритании N 1263956A, кл. С 3 Н, С 12 D 13/10, опублик.

1972.

Фалина Н.Н. Выращивание зимнего опенка Flammulina velutipes (Fr) $ю для получения мицелия и протеолитических ферментов. В сб.: Производство высших съедобных грибов в СССР. Киев

"Наукова думка", 1978, с. 111-1 14.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gray

BKMf 2459 Д вЂ” продуцента фибринолитических и тромболитических ферментов, которые могут быть использованы в медицине.

Известно использование в качестве продуцентов тромболитических фермен„„SU„„1137762 A1 (5t)5 С 12 N 15/00, 9/50// (С 12 N 15/00, С 12 R 1:645) 2 (54) ШТАММ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Coprinus domesticus (Fr) Gray ВКМЕ

2459 P вЂ” ПРОДУЦЕНТ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Штамм базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gràó (Всесоюзная коллекция микроорганизмов ИБФМ

АН СССР, коллекционный номер BKMf

2459 Д) вЂ” продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов.

\ тов патогенных микроорганизмов (м/о) из рода Streptococcus и непатогенных м/о, например плесневых грибов р.

Aspergillus и др.

Однако использование как патогенной, так и непатогенной микрофлоры имеет серьезный недостаток, связанный с природой этих организмоввЂ” .. они спороносят в культуре, что способствует профессиональным и аллер1137762 гическим заболеваниям людей, кроме того, ферменты тромболитическог о действия из и/о оказывают ряд побочных эффектов »а живой организм что так9 5 же ограничивает их использование.

Иэвест»о »риме»ение в качестве источника тромболитических и фибринолитических ферментов плодовых тел баэидиального гриба Tricholoma рог- 10

tentosum (Fr) Quel, собранных в местах естественного произростания. Однако неравномерная доступность исходного сырья и зависимость плодообразования гриба от ряда биологических 15 факторов ограничивают использование этого продуцента для выделения иэ него тромболитических ферментов.

В связи с этим большой интерес представляют культуры высших базиди- 20 альных грибов (среди которых имеется большая группа съедобных), произрастание которых в искусственных условиях является регулируемым процессом, причем мицелий этих грибов не имеет 25 спороношения, что исключает опасность соответствующих заболеваний, Известен способ получения тромболитического фермента из культуры базидиального гриба Armillaria mellea . 3p

Способ характеризуется сложным, многоступенчатым методом выделения внутриклеточного фермента из мицелия гриба.

Известен штамм базидиального гриба F14mmulina velutipes (Рг) Karst

N0385 (хранится в коллекции лаборатории биохимии грибов Ботанического института им. В.Л.Комарова АН СССР), продуцент внеклеточных тромболитических и фибринолитических ферментов.. 40, Максимальная тромболитическая активность (ТА) культурального фильтрата (КФ) составляла 9-10 ч инаступала на 6-7 сутки выращивания гриба.

Тромболитический препарат, полученный из КФ, лиэировал тромбы крови за

2 ч, имел фибринолитическую активность .(ФА) 15 тыс., фибриногенолитическую активность (ФгА) 1:250 и сопутствующую молокосвертывающую (MCA) и казеинаэную активность (КА) 60 ед. и

О, 1 ед. соответственно. Выход препарата составлял 100 мг с 1 л КФ.

Целью изобретения является новый, штамм базидиального гриба Coprinus

domesticus (Fr) Gray вЂ” продуцент тромболитических и фибринолитических ферментов. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино на Оке) и имеет регистрационный Ф BKMf 2459 Д.

Новый штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки.

Культура Coprinus domesticus поддерживается на косяках суслоагара (сусло 4 по Баллингу, агар 207), хранится в рефрижераторе при +4+2 C или под слоем стерильного вазелинового масла при комнатной температуре, имеет при этом следующие микроскопические признаки вЂ” мицелий белый, с возрастом серовато-коричневатый, обратная сторона колонии гладкая, агар не окрашен, Чашки Петри полностью зарастают мицелием на 11-13 сутки роста.

Микроскопические признаки вЂ” мицелий состоит из двух типов гиф вЂ широк

3-5 мкм в диаметре и тонкие генеративные, около 2 мкм. Пряжки встречают ся регулярно на генеративньгх гифах.

Характерным признаком этой культуры является обильное образование склероциев. В течение всего периода развития гриба он остается на вегетативной стадии и не образует органов спороношения.

Физиолого-биохимические признаки.

Культура гриба интенсивно развивается при 26-28 С. Активно синтезирует фибрино- и тромболитические ферменты на средах с органическими источниками азота и углерода на фоне минеральных солей (калий фосфорно-кислый одно- и двузамещенный, сернокислые магний, марганец, цинк, железо, хлористые натр и калий). Биосинтез ферментов стимулируется солодоворостковым и кукурузным экстрактами.

Coprinus domesticus вЂ” культура дереворазрушающего гриба, относится к возбудителям бурой гнили древесины, дает отрицательный тест на реакцию

Бавендамма на среде с таннином.

Штамм-продуцент выращивают глубинно в колбах на 0 5 л, содержащих

100 мл питательной среды, при 25л-1 С на качалке при 130-160 об/мин. Посевной материал вносят в виде суспензии (иэмельченная пленка мицелия) в количестве 107. от объема среды. Для посевного материала и для культивирования гриба, используют питательную среду следующего состава, г/л: глюкоза

5, 113

10, пепгон 2,5; КН РО 0,6; К НРО

0,4; ИдБО4 ?Н аО О, 05; NaC1 О, 5; CaClz

0,05; РеБО 0,005; ZnS04 0,001;

MnS04 0 003 солодово ростковый экстракт 0,)X (по сух. весу), вода водопроводная до 1 л, рН среды после стерилизацйи 6,0-6,2. При выращивании в указанных условиях максимальная ТА достигается на 6 сутки.

Мицелий отделяют от КФ фильтрованием и в КФ определяют ТА. У С. domesticus она составляет 5-6 ч (табл.1).

Kaid видно из таблицы, тромболитическая активность в КФ Coprinus domesticus по усредненным данным в 2,2 раза выше чем в КФ Flammulina velutipes.

Тромболитический препарат из КФ

С. domesticus получают методом депигментации на анионообменнике ФАФ с последующим дробным осаждением зтанолом (при -20 С) в соотношении 1:1 и

1:3. Ферментативная активность препарата: ТА 1 вЂ” 2 ч, ФА 15 тыс., ФгА

1: 1024. Балластная сопутствующая

MCA 16,5 ед., КА 0,1 ед. Выход препарата составляет 140-150 мг с 1 л

КФ (табл. 2).

Таким образом препарат из С. domesticus сохраняет высокую специфическую активность (ТА, ФА, ФгА), причем ФгА в новом препарате в 4 раза выше, а балластная МСА в 3,6 ра, за ниже по сравнению с препаратом иэ

F. velutipes. Выход препарата увеличивается на 40-507.

Указанные активности определяют общепринятыми методами: ТА (в ч) по методу Имшенецкого и Броцкой, расчет в ед. по Псурцевой, Денисовой, ФА по методу Аструпа и Июллертца, ФгА по Эстеоло, MCA H KA no (13), фибринолиз in vivo no (14), тромболизис in vivo. Ферментативные активности рассчитаны на 1 мг белка °

Ферментные препараты из С. domesticus u F. velutipes сравнивались в опытах in vivo при изучении процессов фибринолиза и тромболиза.

Таким образом, в опытах in vivo при введении препаратов из С. domesticus (в дозах в 3 раза меньшей) достоверно подтверждено увеличение фибринолиза животных через 5 мин на 4247 (по Ковальскому) и на 403

7?62

Ч. (по Аструпу) и через 30 мин соответ-, ственно на 30 и 207,.

Результаты испытаний на способ ность лиэировать тромбы, искусственно созданные в кровеносном русле животных, представлены в табл, 4, Данные табл. 4 свидетельствуют о достоверном превосходстве тромболити10 ческого препарата из нового штамма

С. domesticus вЂ” его введение в дозе, меньшей в 3 раза, обеспечивает практически полное рассасывание тромбов (99,5X).

15 Преимуществами предлагаемого нового штамма Coprinus domesticus

BKMf Ф 2459 Д являются:, способность шт..мма продуцировать тромболитические ферменты в КФ с ак20 тивностью в 2,2 раза выше чем в КФ

F. velutipes, возможность увеличения выхода препарата в 1,5 раза; наличие в новом препарате ФгА в

25 4 раза более высокой, а балластной MCA в 3,6 раза более низкой чем в препаратах из Г. velutipes; препарат из КФ С. domesticus в дозе, в 3 раза меньшей чем препарат

30 из КФ F. velutipes, обеспечивает достоверное увеличение фибринолиза животных через 5 мин на 424Х (по Ковальскому) и на 40Х (по Аструпу) и через 30 мин на 30 и 207. соответст35 венного препарат из КФ С. domesticus в дозе, в 3 раза меньшей чем препарат из

КФ F. velutipes, обеспечивает практически полное рассасывание внутренних

40 тромбов (99,5X).

Промышленное культивирование баэидиомицетов, в том числе штамма

С. domesticus (Fr) Gray ВКИЕ 2459 Д, может осуществляться на любом обору45 довании микробиологических производств, предназначенном для выращивания м/о. Производственные помещения при этом свободны от спороносящего мате риала.

50 Использование базидиальных грибов

s качестве продуцентов фибрино- и тромболитических ферментов открывает новую сырьевую базу для их получения и расширяет существующий узкий ассор55 тимент этих остро необходимых медицине ферментов.

1137762

Т а б л и ц а 1

Сравнительная характеристика ферментативной активности в КФ при культивировании грибов Coprinus

domesticus u Flammulina velutipes

Вид гриба

Возраст Тромболитикультуры, ческая аксут. тивность ч ед.

Гlammulina velutipes 6

9 83

10 70

Coprinus domesticus 6

6 150

5 190