Способ получения гибридных клеток

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, включающий слияние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, отличающ и и с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения во времени, элиминащоо родительских клеток проводят поеледов1ательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов.

COOS ИМЗЕТСНИХ

tgUNI

РЕСПУБЛИК ае 01) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н asòîèñí ì сеидатвъсрвм

ГЮСЗЩМРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3628117/28-13 (22) 21.07.83 . (46) 07.02.85. Бюл. Р 5 (72) А.Н.Наровлянский, А.М.Амченкова, О.Н.Щегловитова и Я.Е.Хесин (71) Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им..почетного акад. Н.Ф.Гамалеи (53) 663. 18:615.45(088.8) (56) 1.Xha K.K. et al Somatic cell

genet. 1976, ч. 2, р. 215-233.

2. Littlefield Y.W. Зсъепсе. 1964, v. t45, р. 709-710 (прототип).

4(51) С 12 N 15/00; С 12 N 5/00, С 12 N 5/02 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ

КЛЕТОК, включающий слияние. клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание.и клонирование гибридных клеток, о т л и ч а ю " шийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения во времени, элнминацию родительских клеток проводят последовательным использованием интерферонов и .цитоцидных вирусов.

4 11384

Изобретение относится к медицине, биологии, сельскому хозяйству, иммунологии, в частности к генетике соматических клеток.

Метод гибридизации соматических клеток в последние годы приобрел исключительно важное значение при решении практических и теоретических задач биологии, медицины и сельского хозяйства..Он используется для кар-10 тирования,локапизации генов в хромосомах, для анализа. регуляции генов в клетках эукариотов, изучения механизмов контроля роста и дифференцировки клеток в процессах развития зародышей, заживлении ран, образовании опухолей. Применение этого метода в медицинской практике расширяет

° возможности генетического консульти. рования, выявления латентных опухолеродных вирусов, проверки опухолевых клеток на присутствие в них онкогенных вирусов. Наконец, гибридизация клеток лежит в основе получения гиб- . ридом продуцирующнх моноклональные 25 актитела, которые находят разнообразное применение в иммунологии и биохыкии.

Известен способ получения гибридных клеток, в котором используется селективная система, характеризующаяся те ., что в,ней маркируется одна родительская клетка, представляющая собой двойной мутант, устойчивый как к тиогуанину, так и к уабаину (Уа ). При слиянии такой мутантной

35 клетки с нормальной клеткой, чувствительной к уабаину (ГГФРТ+, Уа ), .

Ч образуются гибриды, способные расти в селективной среде, содержащей

40 гипоксантин, аминоптерин и тимидин, так называемой среде ГАТ, в которую также добавлен уабаин..Родительские клетки в этих условиях элимини,руются $1).

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения гибридных клеток с помощью выращивания мутантных клеток, устой- 50 чивых к азагуанину (АГ") (в клетках отсутствует фермент ГГФРТ) и бромдезоксиуридину (БУдР) (в клетках отсутствует фермент тимидинкиназаТК), их слияния с применением поли- 55 этиленгликоля (ПЭГ) кпи вируса Сендай и выращивания на селективной среде ГАТ, где родительские мутант12 2 ные клетки погибают, а гибридные выживают f2j.

Недостатками известных способов являются необходимость получения н выращивания мутантных клеток, длительность процесса получения и изучения мутантных клеток, необходимость использования дорогостоящих биологически активных веществ.

Цель изобретения - упрощение способа и сокращение во времени.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения гибридных клеток, включающему слияние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, элиминацию родительских клеток проводят последовательным использованием интерферонов и цнтоцидных вирусов.

Способ осуществляют следующим образом.

Родительские клетки скрещивают, выращивают на питательной среде до монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, удаляют из культуральных флаконов клетки сначала одного родителя, а затем другого и культивируют оставшиеся клетки до .образования колоний. Для скрещивания используют интерферончувствительные клетки родительских линий. Удапение родительских клеток производят путем последовательной обработки сначала интерфероном, специфическим дпя одного вида родительских клеток, и заражения цитоцидным вирусом, элиминй.руя таким образом родительские клетки другого вида, и далее, после отмывания культуры, внесением в нее интерферона, специфического для второго вила клеток, заражением цитоцидным вирусом, который элиминирует родиI тельские клетки первого вида, в результате чего сохраняются лишь гибридные клетки.

Пример . Выделение гибридных клеток при скрещивании в суспензии перевиваемых клеток мыши L 9<> и перевиваемых человеческих клеток J 9g.

Для слияния используют культуру человеческих клеток У-96, чувствительную к человеческому лейкоцитарному интерферону, и линию мышиных клеток „5 5, чувствительную к действию мышйного интерферона. Слияние проводят с помощью 50Х-ного растСоставитель В.Кузьмичев

Редактор И.Дербак Техред М;Надь. Корректор О.Билак

Заказ 10634/18 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 11384 вора ПЭГ-1550. Снятые трипсином а отмытые клетки Х-96 в количестве

6 10 и L>>> в количестве 9 ° 10 и 4 перемешивают, центрифугируют 10 иин при 250Р; надосадок отсасывают и на клетки наслаивают 1 мл раствора

ПЭГ, перемешивают легким потряхиванием 80 с, дважды промывают средой .

199 с последующим центрифугированнем и высевают во флаконы нли чашки Пет- tO ри из расчета 3.10 клеток/мп с 20Х эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), через 2 ч меняют среду на свежую того же состава.

Полученная в результате слияния смесь клеток состоит из родительских клеток обоих видов и двух групп многоядерных клеток: гомокарионов, содержащих ядра одного трпа клеток, и гетерокарионов (ипи гибридных клеток), содержащих ядра обоих родительских типов. Для избирательного выделении и размножения гибридных клеток необходимо добиться гибели всех названных типов клеток, кроме гетерокарионов. Через 18 ч среду заменяют на среду 199 с 2Х эмбриональной сыворотки КРС с добавлением мышиного интерферона из расчета 50 ед/мл.

Через 6 ч вводят вирус везикулярного >О

12 4 ,стоматита (BBC) из расчета 2 10 ТПД /мл.

Через 18 ч, т.е. после гибели человеческих клеток н гоиокарионов, не несущих рецепторов к мышиному интерферону, клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки). Заливают среду 199 с 20Х эмбриональной сыворотки КРС с добавлением.человеческого лейкоцитарного интерферона из расчета 80 ИЕ/мп.

После 6 ч вводят вирус ВВС из расчета

2 10 Т1Щ /мл. Через 18 ч клетки отиывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки) и заливают средой 199 с 20Х эмбриональной сыворотки КРС с добавлением глютамина.Колонии гибридных клеток, появляются через2 недели, их реклонируют и размножают.

Предлагаемый способ позволяет полу" чить гибриды соматических клеток. ,Иетод применим как дпя получения межвидовых гибридных клеток, когда родительские культуры чувствительны к интерферону, так и дпя получения внутривидовых гибридов в случае,,если один из родительских парт. неров не чувствителен к интерферону.