Способ получения @ -молочной кислоты

 

СПОСОБ ПОЛУЧьНИЯ 13-МОЛрЧНОЙ . Кислоты путем сбраживания глюкозы или лактозы бактериями рода LactobacHlOs в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН 4,5 - 7,0 и температуре 3050 С с послепутшим выделением целевогЪ гфодукта, отличающийс я тем, что, с целью повьшения в ыхода кислоты, из бактерий рода Lactobaci Mus используют штамм .Lactobacillus bulgaricus DSM 2129.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУВЛИН Ф ." Д C g

М! Ма@

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ С СР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

1 (21 ) 3476930/28-13 (22> l ОЛ8. 82 (31) P 3131.717.0

<32) 11.08.81 (33) ФРГ (46) 07;02.85. Бюл.й 5 (72) Хартмут Фельсков и Дитер Сукач (ФРГ) (711 Хехст АГ (ФРГ) (53) 577.15(й)88.8) (561 1.Патент Великобритании

В 1157213. кл. 0 2 С, опублик. 1969.

2.Патент ПНР Ф 63329, кл. 6 в 16/02, опублик. 1971. (51) С,12 P 7/56 С 12 К 1/225

""-: - /

Ъ-. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 10-МОЛОЧНОЙ

КИСЛОТЫ путем сбраживания глюкозы или лактозы бактериями рода Lactobacillus в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН 4,5 — 7,0 и температуре 3050 С с последующим выпелением целеа вого продукта, о т л ц ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода кислоты, из бактерий рода LactobaciIlus используют штамм .Lactobacillus bulgaricus DSH 2129.

1139375

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения 0-молочной кис-, лоты сбраживанием сахаров.

Известен способ получения:0-молоч- 5 ной кислоты путем сбраживания глюкозы или свеклосахарной мелассы в присутствии питательных минеральных солей штаммом Lactobaci11us 1еichmannii АМСС 4797. Выход за бО ч составляет 113 г 0-молочной кислоты PI ).

Наиболее близким к изобретению является способ получения 0-молочной кислоты, заключающийся в сбраживании глюкозы или лактозы молочного саха- 15 ра бактериями рода Lactobac i11us на питательной среде в присутствии источника азота, карбоната кальция, регулирующего рН среды, и других питательных минеральных солей в 20 анаэробных условиях при рН предпочтительно 5,1 и температуре до 50 С с последующим выделением 0-молочной кислоты. Выход кислоты составляет до /О г (2). 25

Целью изобретения является повышение выхода D-молочной кислоты.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения

D-молочной кислоты, предусматриваю- 30 щему сбраживание глюкозы или лактозы бактериями рода Lactobaci1lus в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при 35 рН 4,5-7,0 и 30-50 С с последующим выделением целевого продукта из бактерий рода LactobacIIIUS используют штамм Lactobaci11us bulgar1сиэ DSM

2129. /40

Используемые дляполучения 0-молочной кислоты штамм 1.actobaci11us

buIgaricus 0SM 2129 выделен из подкисленной молочной пробы и улучшен планомерной селекцией таким образом, 45 что продуктивность его за 48 ч достигает 115 г/л молочной кислоты.

Ц!тамм депонирован в немецкой коллекции микроорганизмов под номером

DSM 2129. 50

Идентификация штамма показывает, что он состоит из длинных грамположительных палочек, отрицательных к каталазе, неподвижных, микроаэрофильных „ 55

Биохимические характеристики.

Обмен веществ. Гомоферментативное молочнокислое брожение: газ из глюкозы газ иэ глюконата рост при I5 C рост при 45 С +

Образование кислоты из: рибозы арабинозы ксилозы маннита сорбита глюкозы галактозылактозы мальтозы сахарозы трегалозы целлобиозы мелибиозы раффинозы салицина амигдалина

Расщепление аргинина

Конфигурация молочной кислоты:

D /-/.

Диаминопимелиновая кислота в стенке клетки: никакой.

Штамм Lactobaci11us bulgaricus

DSM 2129 не специализирован на бро1 жении глюкозы, а может сбраживать (ферментировать) молочный сахар почти так же быстро, как и глюкозу, до молочной кислоты. Таким образом, имеющуюся в больших количествах, в качестве отходов молочной промышленности, свежую молочную сыворотку или в виде суспензии порошка молочной сыворотки можно использовать в качестве источника сырья для производства 0-молочной кислоты.

Используемые,цляполучения D-молочной .кислоты питательные среды составляются известным образом. Они наряду с глюкозой и/или молочным сахаром содер>кат также источник азота, например мясной экстракт,.кукурузную набухающую в воде муку (Cornstupj или соевую муку. Кроме того, добавляют минеральные соли, витамины и поверхностно-активные средства. B качестве поверхностно-активных средств используют продажные неионные поверхностноактивные вещества, прежде всего жидкие продукты. Эти поверхностно-активные вещества содержат в качестве биологически активного вещества полиоксиалкилаты, например продукты взаимодействия спиртов и кислот С этиленоксидом и/или пропиленоксидом, 1139375

В качестве спиртов используют однои многоатомные спирты. Такие, как жирные спирты", смоляные спирты, глицерин, зритрит, пентаэритрит; или сахарные спирты, такие как сорбит, и маннит; в качестве кислот прежде всего используют жирные и смоляные кислоты. Бла- гоприятны также неполные сложные эфиры из таких многоатомных спиртов и указанных кислот, как оксиэтилаты ангидросорбит-моноолеата.

Так как Lactobacillus bulqaricus

DSM 2!29 чувствителен к кислотам, то образующуюся молочную кислоту нужно связывать с, помощью гидроокси- !5 дов, или карбонатов щелочных или щелочноземельных металлов, в особенности карбонатомкальция.рН-Значение, таким образом, поддерживается в области 4,5-7,0, предпочтительно 6,5- 20

6,8.

Любую питательную среду перед посевом Lactobacillus bu!garicus

DSM 2!29 стеарилизуют, чтобы устранить возможные загрязнения за счет 25 посторонних организмов. Для этого достаточно нагреть питательную среду в течение !5 мин при !21 С.

Как и для всех молочнокислых бро-: ж ний (ферментаций),для предлагаемого способа требуются анаэробные условия. Для этого достато .но образующейся благодаря нейтрализации молочной кислоты карбонатом кальция, двуокиси углерода или обогащения фермен- 3 тационной среды азотом.

Молочнокислое брожение осуществляют"в температурном интервале 30-50 С .. о

Особенно благоприятный температурный интервал 40-45 С.

Из осаждающейся по предлагаемому способу соли 0-молочной кислоты можно получить свободную 0-молочную кислоту с помощью ионообменника или в случае лактата кальция путем подкисления серной кислотой.

Пример 1. Рост штамма Lactobacillus bu1garicus USM 2129.

Находящийся в пробе сброженного молока штамм Lactobacillus bulgar1cus вьщеляют и культивируют в следующей среде l, г/л:

Казеиповый пелтон (триптичдски усвоенный )

Мясной экстракт (Меrck) !О

Дрожжевой экстракт 5

Глюкоза 20

К НЩ

Ацетат натрия 5

Мц504.7Н О 0,2

MnS0 .Н О 0,05

Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л

Затем пробы штамма разбавляют и производят посев на агаровые пластин- ки, которые приготовлены из той же среды с добавкой 1,8Х агара. Инокулированные агаровые пластинки затем в течение дня выдерживают при 45 С в анаэробных условиях в термостате.:

В целом затем извлекают 30 отдельных колоний и, смотря по обстоятельствай, вносят в пробирку, которая содержит следующую среду 4, г/л:

Глюкоза 50

СаСО 70

Дрожжевой экстракт 7

Кукурузная набухающая мука (сухая) l5

Ацетат натрия 5

Неионное поверхностноактивное вещество .1 мл/л:

Время культивирования составляет

24 ч при 45 С. Спустя 24 ч отчетливо видна разница между различнымй хорошо сброженнымикультурами и обра зовавшимися количествами 0-молочной кислоты, Пробирку с самым большим количеством 0-молочной кислотыисполь зуют для нового мазка на стекле. Этот процесс повторяют регулярно в течение 8 нед., и при .этом содержание сахара в среде повышают сначала до

8Х и спустя следующие 5 нед. до 10Х.

Затем штамм селекциочируют следующие

12 нед. до тех пор, пока он не станет способен метаболизировать 100.r глюкозы/л среды в течение 24 ч на

55Х, причем образуется 55 г .0-молочной кислоты/л. Полное разрушение глю" .козы наблюдается спустя 36-40 ч.

Пример 2. Полученный согласно примеру 1 штамм Lactobacil!us

bulgaricus помещают в пробирки, которые содержат по 15 мл среды. Пробирки для культуры ставят вертикально при

45 С по меньшей иере на 8 ч и. самое ,рольшее на 20 ч и затем используют в качестве инокулята для культур в колбах Эрленмейера, которые содержат по 250-мл среды 1. Их также выдерживают при 45 С 8-20 ч. Содержимое 6 указанных колб Эрленмейера затем служит в качестве инокулята для фермента

5 I I 39375 ь

20 емкостью 30 л, в который предварительно помещена следующая среда 2, г/л:

1 люк о за 30

Дрожжевой экстракт 7 5

Казеиновый пептон 10

Кукурузная набухающая мука (сухая) 20

Лцетат натрия 5

Неионное поверхностно10 активное вещество мл/л

Ферментеры перемешивают со скоростью 100 об/мин, и спустя 8-12 ч при 45 С в ферментер загружают содержимое в количестве 270 л, которое содержит либо указанную в примере среду, либо следующую среду 3, г/л:

Глюкоза 30

СаСОэ 70

Дрожжевой экстракт 7

Соевая мука 15

Ацетат натрия 5

Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л

После выращивания культуры, т.е. спустя 7 ч, добавляют еще глюкозу.

При добавлении глюкозы руководствуются потреблением глюкозы и образованием кислоты. В целом в течение примерно 45 ч добавляют такое количество 30 глюкозы, которое составляет примерно

10 вес.% питательной среды. Из глюкозы образуется II5 r 0-молочной кислоты питательной среды (равно

Iбб г лактата кальция). Выделение свободной молочной кислоты осуществляют известными способами, а именно осаждением кальция серной кислоты, фильтрацией, выпариванием и очисткой, путем перегонки в виде слож-,111 ного этилового или метилового эфира.

Применение среды 3 имеет то преимущество, что в целевом продукте ле содержится обнаруживаемого количества L-молочной кислоты. Среда 4 имеет 1 преимущество в том, что она после ферментации лучше фильтруется, чем среда 3, так как соевая мука в среде

3 разрушается только частично. Полу ченный с помощью среды 4 продукт so содержит 2% L-молочной кислоты, которая происходит из кукурузной набухающейся муки в среде.

После фильтрации возможно расщепление доли L-молочной кислоты путем 5. пропускания фильтрата через ферментивный реактор, который содержит фермент, расщепляющий специфически

L-молочную кислоту. Пригодны системы с L-лактатоксидазой, 1 -лактатдегидрогеназой или цитохромом b2.

Лактатдегидрогеназа нуждается в качестве кофактора в NAD, который также может быть связан с носителем и затем может. регенерироваться и применяться вновь. Дпя цитохрома Ь пригоден в качестве кофактора гексацианоферрат, который может снова повторно окисляться с помощью электри- ческого тока на электроде из благородного металла.

Пример 3. Согласно указанному в примере 2 способу готовят штаммкультуру и инокулят, однако в качестве питательной среды применяют следующую среду 5, которая содержит молочный сахар в качестве сбраживаемого субстрата, г/л:

Порошок молочной сыворотки 60

СaCO„ 70

Дрохскевой экстракт 3

Соевая мука 5

Лцетат натрия 5

Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л

Как и в примере 2, после выращивания культуры добавляют дополнительно сахарный субстрат, а именно до тех пор, пока добавленное в целом количество молочного сахара .не составит 130 г/л. Образование молочной кислоты длится ческолько дольше, чем в примере Z, однако спустя 50 ч заканчивается. В остальном поступают описанным в примере 2 образом. Выход

0-молочной кислоты составляет

l00 г/л.

Пример 4. 1цтаммовая культура и инокулят готовятся при насыщении азотом, как в примере 1. Используют среды 3,4 или 5, однако они сначала не содержат СаСО .Его в сухом ниде или в виде 20%-ной суспензии добавляют потом, так, чтобы рН не снижалось ниже 5,5. Спустя

48 ч начинают дополнительное дозивование питательного раствора. Ско- l рость разбавления составляет 0,01 л/ч на литр питательного раствора, причем равные количества жидкости непрерывно извлекают из ферментера.

Скорость разбавлениямедленно увеличивают до величины 0,04 л/ч на литр питательного раствора, причем слив из ферментера имеет содержание 0-мо375

Составитель Н;Привалова редактор В.Данко Техред С.Мигунова Корректор А.Ильин

Заказ 10711/46 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий !

13035,MocKBa,Æ-35,Раушская анб.,д.4/5

Филиал ППП "Патент",г.Ужгород,ул.Проектная,4

7 1139 лочной кислоты 5-7Х. Клеточную массу непрерывно отделяют от слива с помощью непрерывно функционирующего сепаратора и на 907. возвращают в ферментер. В выделенной части устанавливают рн 6,5 с помощью гидрокси-, да кальцияи упариваютдо 1/10 еепер- ° воначального объема. Б низкотемпера- турной ловушке концентрат охлаждают до 4 С, при этом выкристаллизовывает-1 ся лактат кальция. Концейтрированный раствор непрерывно подают в низкотемпературную ловушку, в то время как осадившийся лактат кальция выводят в регулярные интервалы с помощью ши- 15 бера. маточный раствор возвращают в ферментер. Выделение молочной кислоты из полученного лактатл кальция осуществляется с помощью серной кислоты и путем последующей фильтрации. 20

Выход составляет 110 г 0-молочной кислоты на литр питательной среды.

Пример 5. Повторяют непрерывное получение молочной кислоты I согласно примеру 4 с,тем различием,,что для регулирования рН испопьзуют не СаСО, а гидроксид натрия. Преимущество этого способа заключается в том, что он позволяет поддерживать рН при 6,5-6,8, благодаря чему ско рость брожения Lactobaclltus bu loaricus D5M 2 29.повышается. Образовавшийся раствор лактата натрия пропус кают через ионообменные колонки, которые абсорбируют молочную кислоту.

Как только колонка будет загружена молочной кислотой, последнюю элюируют соляной кислотой. После регенерации разбавленным раствором гидрокси да натрия колонку снова можно использовать для адсорбции молочной:кислоты. выход D"ìîëo÷íoé кислоты 115 г на литр питательной среды.

Использование предлагаемого способа обеспечивает более высокийвыход целевого продукта и получение его оптически чистым.