Штамм перевиваемых клеток мсв,используемый для культивирования риккетсий и вирусов

 

Штамм перевиваемых клеток МСВ № 44/6/ (коллекция перевиваемых клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР), используемый для культивирования риккетсий и вирусов. (П с:

СО03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

4(5Ц С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ASTQPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАЯ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3526935/28-13 (22) 18. 11.82 (46} 15; 02, 85. Бюл. М 6 (72) О.С. Гудима, Н.К. Мисуренко и A.Ì. Амченкова (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика

Н. Ф, Га мал еи (53) 576.8.093.35(088.8) (56} 1. Earle W R. Changes Induced

in à Strain of Fibroblasts from а Strain СЗН House by the Action of

20-Hethylcholautren (preliminary

Report). — J. Nat Cancer Just, 1943 3.

2. Стромская Т.П., Ставровская А.А .

Кариотипические особенности и прививаемость некоторых клеточных линий млекопитающих. — "Вопросы онкологии",1974 т. 20, У 2, 60 (прототип).

„„SU„, 1! 397И (54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК МСВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

РИККЕТСИЙ И ВИРУСОВ. (57) Штамм перевиваемых клеток МСВ

Н 44/6/ (коллекция перевиваемых клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского AlfH СССР), используемый для культивирования риккетсий и вирусов.

/ l 139751

Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований.

Известна перевиваемая линия клеток L полученная из эмбрионов мы— шей (1 ).

Однако она контаминирована микоплаэмами, вирусами и клетками других линий . IO

Известен также штамм перевиваемых клеток мышей М-22 с высокой интенсивностью размножения ь.2 3.

Этот штамм получен путем трансформации эмбриональных фибробластов 15

ы,>шей С57В Ь вирусом SV-40, однако он не способен пролиферировать при супраоптимал иной температуре.

Целью изобретения является получение нового штамма перевиваемык 20 клеток, обладающего высокой интенсивностью размножения, формирующего стабильный пласт фибропластоподобнык клеток, чувствительного к воэбу— дителям риккетсиозных инфекций и 25 вирусам, не контаминированного микоплазмами и вирусными агентами и способного пролиферировать при супра,оптимальных температурах.

Поставленная цель достигается ЗО с помощью штамма перевиваемых клеток MCB.

Штамм хранится в коллекции перевиваемык клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 44/6/.

Для получения штамма MCB перевиваемых клеток используют эмбрионы, стерильно извлеченные из матки мышей С57В /6/в последние дни бере — 4О менности. Тела эмбрионов измельчают и подвергают трипсинизации при 37 С в 0,25%-ном растворе трипсина. Суспензию клеток в концентрации 1-10 клеток в 1 мп среды 199 с 10% сыво- 45 ротки крупного рогатого скота в объеме 250 мл вносят в матрацы.

В первый месяц культивирования п1 оизведены два пересева в отношен lH 1:2. После второго пересева размножение клеток практически прекра— щается. В матрацах образуется рыхлая сеть, состоящая из крупнык, полиморфных клеток с длинными отростками.

Жизнеспособность этих клеток поддерживают, периодически сменяя питательную среду. Через 3 мес после первичного высева эмбриональных клеток в одном из шести матрацев обнаруживают колонию мелких, округлых плотно прилегающих друг к другу клеток. Размеры колонии постепенно увеличиваются за счет митотического деления клеток. Колонию снимают с поверхности стекла матраца и переносят в пробирку с 1 мл питательной среды. Клетки этой колонии являются началом перевиваемой линии клеток MCB. Линия клеток MCB поддерживается в лаборатории риккетсиозов ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в течение 6 лет, проведено свыше 350 пассажей с высоким индексом пролиферации — 6.

Штамм перевиваемык клеток МСВ имеет следующие морфологические„ физиологические и кариологичЕские характеристики.

Культура MCB состоит из фибробластоподобных клеток веретеновидной и полигональной формы с четкими границами. Ядро круглое или овальное, четко контурировано, содержит

2-3 небольших ядрышка, кариоплазма заполнена мелкозернистым хроматином.

Цитоплазма клеток мелкозернистая, как правило, не вакуолизирована, без включений.

Рост клеток однослойный.

При фиксации препаратов жидкостью

Буэна или смесью по Шабадашу окраска их гематоксилином и зозином несколько слабее, чем, например, перевиваемых мышинных клеток Ь.

При высеве единичные клетки в процессе размножения образуют островки полигональной формы, которые по мере роста сливаются, формируя сплошной пласт клеток. При высеве 10 клеток в 1 мл сплошной пласт в пробирке или флаконе (матраце) образуется на

4-5-е сутки. Клетки легко отделяются от стекла 0,02%-ным раствором версе3 на, 0,25%-ным раствором трипсина или механическим путем.

Ддгезивная активность клеток хорошая.

Пересев клеток MCB производят после образования сплошного пласта.При пересеве механическим путем из сосуда удаляют старую питательную среду и добавляют 1-10 мп (в зависимости от емкости сосуда для культивирования) свежей среды, в которую очищают шпаделем клетки со стекла. Взвесь клеток доводят свежей питательной средой до требуемой концентрации и

1139751

Чувствительность к микроорганиз»° мам.

Перевиваемая линия клеток MCB чувствительна к риккетсиям возбудителя эпидемического сыпного тифа ."Э . (Rickettsia prowazeka) и риккетсиозной оспы (R. akari) и к вирусам VSV и ЕМС. высевают в новые сосуды. Пересевы с помощью версена или трипсина производят по известной методике., Культура клеток MCB адаптирована к питательной среде следующего соста— ва: среда 199 отечественного производства с 10Х (нативной) сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков. Добавление антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ед/мл) — не влияет на морфологию и пролиферативную активность клеток MCB.

Хранение клеток МСВ.

Для поддержания жизнеспособности 5 клеток МСВ их пересевают 1 раз в

4-7 дней при разведении клеточной суспензии 1:5-1:8. В условиях термоо стата при 35 С пласт клеток сохраняется в течение 10 сут без смены пита- 2G тельной среды. При комнатной температуре 18 — 21 С клетки сохраняются в течение двух неделb..

Изучаемая культура является гетероплоидной с широкими колебаниями чис- 25 ла хромосом (20-100) . При этом 9Х клеток содержит более 100 хромосом.

Метафазные пластинки со свойствен— ным для клеток мыши числовым набором хромосом (40) составляют 37 всей клеточной популяции. Модальный класс равен 82-84. Модальный класс составляет около трети всей клеточной популяции. При исследовании 10 метафазных пластинок, входящих в модальный класс, видно, что большую часть хромосомного набора составляют акроцентрические хромосомы (74-80). Кроме того, присутствуют метацентрические и субметацентрические хромосомы; в

8 из изученных клеток были обнаружены микрохромосомы.

Тесты на онкогенность отрицательны. Подкожное введение клеток линии

МСВ гомологичным (мыши линии С57В,1<

L/6) -и гетерологичным (беспородные белые мыши) мышам в дозе 3 ° 10 клеток не вызывало образование опухолей в период двухмесячного наблюдения. !

Уровень накопления риккетсий определяют на пятые сутки после заражения клеток перевиваемой линии MCB путем титрования на разви.— вающихся куриных эмбрионах (РКЭ) 6

7-дневного возраста.

Риккетсии Провачека поддерживаются с сохранением инфекционности в те чениее многих пассажей на клетках перевиваемой линии МСВ со средним уровнем накопления 5,5 1 Д /мл.

Размножение риккетснй Провачека в клетках перевиваемой линии МСВ сопровождается развитием цитопатических изменений.

Культивирование риккетсий и вирусов с использованием штамма перевиваемых клеток MCB.

Пример 1. Способ культивирования риккетсий Провачека, штамм

Brein 1.

В матрацную колбу с клетками линии МСВ на уровне 150-ro пассажа вводят 0,022-ный раствор версена, подогретый до 35ОС. Через 1мин версен удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 35ОС на 5 мин.

Отслоившиеся клетки ресуспендируют в среде роста: среда 199 с 107 сыворотки крупного рогатого скота и разливают на 4 матрацные колбы.Эти культуры 151-го пассажа инкубируют о при 37 С в течение 2 .сут до момента формирования сплошного слоя.

При заражении риккетсиями среду из культуральных сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором

Хэнкса и вводят суспензию риккетсий, полученную из желточного мешка

РКЭ и разведенную 1:50О.

Контакт осуществляют в течение о

2 ч при 35 С. Затем инокулюм удаляют, культуру трижды отмывают раствором Хенкса от неадсорбировавшихся риккетсий и добавляют среду -роста и инкубируют при 35ОС. Сбор риккетсий производят через 4 для после заражения и определяют титр их накопления на 6 — 7 -дневных РКЭ.

Титр равен 5, 5 log I Д /мл.

5о

Часть матрацных колб с риккетсиями, выращенными на клетках перевиваемой линии МСВ, замораживают и хранят в минусором холодильнике.

Храп .ние риккетсий в течение двух лет (время наблюдения) не приводит

;к снижению титра инфекционности.

1139751

Составитель И. Красильников

Техред О.Неце Корр е кт ор А. Ильин

Редактор Т. Веселова

Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 224/19

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Риккетсии Провачека прошли более20 пассажей на культурах клеток МСВ с сохранением титра 5,5 log I Д/мл.

Пример 2. Способ культиви- рования Rickettsia akari, штамм МК.

Клетки перевиваемой линии NCB на уровне 180-го пассажа получают и заражают риккетсиями по способу, описан ному в примере 1. Титр риккетсий равен .,4,5 log Х Д,/мп.

Пример 3. Способ культивирования вируса VSU.

Клетки линии МСВ на уровне 232-го пассажа получают по способу, описанному в примере 15

При заражении вирусом среду из культуральных .сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором Хенкса и вводят 1 мп .среды, содержащий

100 доз вируса, выдерживают 1 ч при 20

37 С, затем трижды промывают раствором Хенкса для удаления -неадсорбировавшегося вируса и заливают поддерживающей средой — среда 199 с 21 сыворотки крупного рогатого скота и инкубируют при 37 С. Сбор вируса производят через 24 ч после заражения (полная. дегенерация клеточного пласта) и определяют титр вируса по раз— ,,витию цитопатического эффекта. 30

Титр равен 10 Т?Щ /мл.

При культивированием вируса на перевиваемой линии клеток его титр равен TlP

Пример 4. Способ культивирования вируса ЕМС.

Клетки линии MCB на уровне 235 — го пассажа получают по способу, описанному в примере 1, а заражение вирусом и инкубирование производят по 4О способу, описанному в примере 3.

Сбор вируса производят через

48 ч после заражения (полная дегенерация клеточного пласта) . Титр равен 10 ТЦЦ5 /мл.

При культивировании вируса EN(, на перевиваемой линии клеток его титр равен 10 ТЦЦ /мп.

Пример 5. Клетки линии МСВ высевают в матрацы со средой 199 и 10Х сыворотки в дозе 10 в 1 мл и через 3-5 сут культивирования их снимают со стекла трипсином, версеном или механическим путем и полученную, суспензию подсчитывают в камере Горяева или Фукса — Розенталя.

Клетки, выращенные на разных сериях среды 199 отечественного производства дают накопление от 5 10 до 10 клеток в 1 мл, т.е. увеличение исходного количества происходит в 5-10 раз.

Перевиваемая лйния клеток MCB в отличие от аналога и прототипа обладает способностью интенсивной про- лиферации при культивировании при супраоптимальной температуре 40 С ! с сохранением высокого накопления клеток, сравнимого с накоплением при оптимальных температурах 35—

36 С.

Способность перевиваемой линии клеток МСВ при 40 С позволяет применять ее в генетических исследованиях, в частности для выделения и изучения температурочувствительных (ts) мутантов риккетсий и вирусов.

Кроме того, перевиваемая линия кле- ток МСВ отличается, высокой пролифе ративной активностью, легкостью субкультивирования, не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки телят, возможностью культивирования как в присутствии антибиотиков, так и без них, обладает устойчивыми морфологическими, .биологическими и уникальными от других перевиваемых линий мышей генетическими особенностями.