Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека лэч-4(81), используемый для диагностики вирусных инфекций

 

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ .

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (! !) 4(!) С 12 Н 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТБУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3545014/28-13 (22) 27.01.83 (46) 30.03.85. Бюл. Ф 12 (72) Н.Н. Глинских, Г.Г.Колесникова, В.П.Устьянцев, С.Ф.Закирова, Л.В.Власова и В.К. Станиславская (71) Свердловский научно-исследовательский институт вирусных инфекций (53) 576 .8 .093 .35(088.8) (56) 1. Hayflick L., Noorchead Р.

The lemited in vitro lifetime of

human diploid cell strains, Symp.

International Society Cell, 1961, 3. р. 155-173 (прототип). (54) ШТАИИ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ЛЕГКОГО

ЭИБРИОНА ЧЕЛОВЕКА ЛЭЧ-4(81), ИСПОЛЬЗУЕИЫИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕ ЩИЙ. (57) Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) к 88-82 (Банк-музей Свердловского НИИ вирусных инфекций), используемый для диагностики вирусных инфекций.

1 1147

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к диаг ностике вирусных инфекций.

Известен штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека wi-38 Ц .

Однако известный штамм получен в США и является труднодоступным для работы.

Цель изобретения — получение отечественного штамма диплоидных клеток 1О легкого эмбриона человека.

Цель достигается с помощью штамма ЛЭЧ-4 (81) .

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) получен 1 следующим образом.

В качестве исходной ткани используют легкое 12-недельного эмбриона человека от здоровой женщины,.не име ющей в генеалогии злокачественных н наследственных болезней. Используемую легочную ткань тщательно отмывают солевым раствором Хенкса с анти- биотиками (пенициллин и стрептомицин по 300 мкг/мл) от слизи и сгустков крови, затем измельчают, тем же раствором Хенкса промывают полученные кусочки и помещают их в колбу для трипсинизации. Щадящую трипсиниэацию кусочков проводят 0,25Х-ным раство- ЗО ром тринсина при температуре 18-20 С

6-кратно по 5 мин. Полученную взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/

/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в среде роста и вносят иэ З5 расчета 300-350 тыс/мл при посадке на посевные матрасы и 500-550 тыс/ /мл — на пробирки. Среда роста клеток состоит нз смеси равелях количеств сред 1.99 и Игла с двойной концентра- 4О цией аминокислот и витаминов с добавлением 10Х-ной сухой сыворотки молодняка крупного рогатого скота.

После формирования монослоя на 45-е сутки роста клетки снимают со стекла 0,02Х-ныл раствором версена, подогретого до 35-37 С, и пересевают

О в соотношении 1:2. Плотный монослой фибробластоподобных.клеток бып сфор-, мирован на 4-е сутки. Для дальнейше- +

ro культивирования бьши отобраны матрасы, содержащие плотный монослой клеток, имеющих четкую структуру, светлую цитоплазму клеток. Последующие пассажи проводят подобным спосо- э» бом.

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) депони-:

748 2 рован под Н 88-82 в Банке-музее

Свердловского НИИвирусных инфекций и характеризуется следующими признаками..

Штамм легкого. эмбриона человека

ЛЭЧ-4(81) имеет ограниченный срок жизни, равный 45 генерациям.

Культура клеток до 4-ro пассажа состоит из фибробластоподобных клеток с примесью эпителиоподобных, а., начиная с 4-го пассажа, культура представляет собой монослой однородУ ных фибробластоподобных клеток, обладающих ориентированным ростом.

Цитоплазма клеток светлая, с легкой зернистостью. Ядра клеток содержат

1-4 ядрышка. Прирост клеток первой фазы роста был 1,5-2-кратным, а, начиная с 4-5-го пассажа, — 2,02,5-кратным на 4-5-е сутки роста.

Мнтотическая активность клеток первых пассажей составляет 8-10 о/оо, а в последующем (в активной фазе роста) — 20-23 о/оо. По мере пасснрования с 25-35-го пассажа увеличивается число клеток с патологическими формами митоза.

Кариологический анализ клеток диплоидного штамма ЛЭЧ-4(81) на разных пассажных уровнях показывает, что 87Х клеток в фазе активного роста сохраняют диплоидный набор хромосом. По мере старения культуры, к 45-му пассажу, увеличивается число клеток с гиподиплоидным набором хромосом, что соответствует естественной изменчивости клеток в третьей фазе роста.

Число клеток с аберрациями хромосом в первых двух фазах роста было незначительным и составляло 12Х; по мере старения клеток число их увеличилось до 4Х. Основные хромосомные аберрации .были представлены хроматидными разрывами.

Клетки свободны от контаминирующих агентов, не обладают туморогенней активностью и на протяжении первых двух фаз стабильно сохраняют свои биологические свойства, присущие штаммам диплоидных клеток, Диплоидный штамм ЛЭЧ-4(81) накоплен в результате пассирования и заложен на хранение в периоде от 4 до 11-го пассажа при температуре жидкого азота -196 С в количестве о

150 ампул с использованием оптимального режима охлаждения:..1 14 7748

Клеточная культура

В том числе различных типов (кор-y) реляция по

37,0 1,0

18,5 0,4-0,6

ФЭЧ 10

Перевиваемая Л-41 5

/Мплоидная ЛЭЧ-4 (81) 5

18,5 О, 4-0,8 после выдержки запаянных ампул при +4-6 С в рефрижераторе в тече-ние 1-2 ч клетки охлаждали со скоростью 0,5 град./мин от 0 до -20 С;

4 град./мин от -20 до -40 С;

10 град./мин от -40 до -80 С.

При восстановлении ампулы с клетками извлекают из сосуда и погружают в водяную баню при 40 С. Содержимое о одной ампулы засевают на матрасы объ- 1О емом 0,25 л, добавляя 30 мл среды роста. Через 24 ч производят смену среды, монослой формировался на 45-е сутки роста. После восстановления.культуру пассируют обычным спосо- 15 бом.

Штамм диплоидных .клеток нашел применение в работе вирусных инфекций. .Клетки штамма ЛЭЧ-4(81) обладают высокой чувствительностью к энтерови- 2щ русам.

Вирусные антигены, приготовленные в культуре ЛЭЧ-4(81), используют в серологических реакциях с антисыворотками, полученными при использоваиии для иммунизации антигена из других клеточных культур, что позво" лило снизить неспецифические реакции, обусловленных наличием общих "тканевых компонентов реагирующих систем.

При обследовании одной из вспышек максимальное число вирусных агентов составило до 37Х на первичнотрипсинизированной культуре ФЭЧ, а на культуре ЛЭЧ-4(81) — всего 18 5Х, 35 так же как, и на перевиваемой линии клеток Л-41. Однако при совпадении спектра выделенных агентов на клетках Л-41 и ФЭЧ было отмечено большее разнообразие агентов на клетках ЛЭЧ-4(81) .

В таблице дана характеристика уровня выделяемости вирусов из первичного материала от больных.

При обследовании 27 проб 45 выделено вирусов

Анализ данных по выделяемости энтеровирусов из материалов, взятых от больных во время ряда отдель ных крупных вспышек, показывает, что при полном отсутствии цитопато-, генных агентов на перевиваемых клетках gН и НЕр-2, выделяемость вирусов на культуре первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона человека ФЭЧ составляет от 2,5 до 50Х, а на клетках штамма

ЛЭЧ-4(81) — от 10 до 45Х по отношению к числу проб, использовайньа(для исследования. В связи с этим использование диплоидного штамма более целесообразно, так как исключает необходимость многократного получения дефицитного сырья (эмбрионы человека) для получения клеток ФЭЧ и обеспечивает возможность одномоментного массового анализа большого числа проб.

Штамм диплоидных клеток отличается выраженной чувствительностью к вирусам респираторной группы— аденовирусу типа 7 и респираторносинцитиальному вирусу (PCB) штамма

Лонг. Максимальный титр накопления аденовируса в культуре составлял 6,.06,5 Lg TlQ ц„ через 96 ч после заражения, а РС — 5,0-5,5 Lg

ТЦД gg(„ в этот же сРок. Эти данные показывают, что штамм клеток ЛЭЧ-4 (8i) с успехом можно использовать для получения вирусных антигенов и соответствующих диагностических препаратов .

Была испытана также чувствительность клеточного штамма ЛЭЧ-4(81) к вирусу простого герпеса (ВПГ) в сравнении с другими культурами.

Для этого проведен ряд последовательных пассажей ВПГ на различных культурах клеток с изучением накопления

ВПГ методом иммунофлюоресценции как в прямом,:так .и непрямом варианте в течение 3 пассажей. Критериями для оценки чувствительности клеток к ВНГ служили : время появления свечения после инфицирования культуры; интенсивность флюаресценции и ее распространенность, которую отмечали "+"— наличие флюоресценции в отдельных клетках; "++" — флюоресценция в группе клеток; "+++" — тотальная флюорес. ценция монослоя. При учете результатов оценивали с стояние контрольных неинфицированных культур.

Составитель Г. Смирнова

Редактор В.Ковтун Техред А.Кикемеэей Корректор О.Тигор

Заказ 1500/25 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5, Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Через !2 ч с момента заражения ,вирусный антиген обнаруживается ,в клетках ПО, а через 24 ч в ФЭЧ и штамме ЛЭЧ-4(81). В остальных клеточных культурах иммунофлнюрес1147748 е ценция отсутствует и ЦПД не наблюдается.

Использование штамка позволит упростить приготовление вирусных

5 диагностических нрепаратов.