Способ получения стрептокиназы

 

СПОСОБ ПОЛЗГЧЕНИЯ СТРЕПТОКЙНА путем периодического культивирования продуцента - стрептококка групШ С в присутствии глокозы и бикарбоната калия с последующю{ отделением культуральной жидкости и двукратным о аждением целевого продукта эта«олом сначала при рН 6,3 - 6,9 и затем, в изозлектркческой точке, о т л и ,ч а ю щ и и с я тем, что, с целью уменьшения расхода пищевого сырья и снижения себестоимости целевого продукта, в качестве продуцента используют Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде 8 которую дополнительно вводят гидролизат казеина с содержанием аю1нного азота 90-220 мг %, а также двузамещен1а1Й фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следукщем соотношении компонентов , мас.%: 0,4-0,9 Глюкоза Двузамещенный фос0 ,1-0,4 форнокислый натрий 0,01-0,02 Сернокислый магний 1.0-1,2 Бикарбонат калия (Л Гидролизат казеина с содержанием аминного азота 90-220 мг Z Остальное 2. Способ (ю п. 1, от л и ч а ющ и и с я тем« что после осаждення концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного р астBopai и сорбционной очистке на фосфа4ib те кал,ьцня. 1 4311 00

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЬЛИК (19) (I I ) 4(5(1С 12 И.. /70

ГОСУДМРСТЬЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЭОЬРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

N k8lQPCNOMV C%44ETEllbCTRV (21) 3618371/28-13 (22} 11.07.83 (46) 30.03.85. Бюл. ff 12 (72) M.M. Немирович-Данченко, В.Н.Алексеева, В.В.Лебедева, Н.М.Шарикова, Б.И.Фейгельман, Ф.И.Буровая и Е.М.Смирнова (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин .и сывороток (53) 577.f5(088.8) (56) 1 . Авторское свидетельство СССР

1 625414, кл. С 12 N 9/70, 1978.

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 944337, кл. С 12 Ч 9/70, 1982 °

3. Авторское свидетельство СССР

Ф 6893f0, кл. С 12 Я 9/70, 1979. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТОЕЯНАф путем периодического культивирования продуцента — стрептококка группы "С" в присутствии глюкозы и бикарбоната калия с последуют(отделением культуральной аидкости и двукратным оридением целевого продукта этано-. лом сначала при рН 6,3 - 6,9 и затем, в изозлектрической точке, о т л и,ч а ю шийся тем, что, с целью уменьшения расхода пищевого сырья и снияения себестоимости целевого продукта, в качестве прадуцента ис- . пользуют щтамм Streptococcus еВЫвьmills 92 1/18-77, продуцент культивируют на питательной среде, в которую дополнительно вводят гидролизат каэеина с содеряанием аминного азота

90-220 мг Ж, а такке двузамещенный фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следующем соотноаении компонентов, мас.Х:

Глюкоза 0,4-0,9

Двузамещенный фосфорнокислый натрий 0,1-0,4

Сернокиалый магний 0,01-0,02

Бикарбонат калия 1,0-f,2

Гидролизат казенка с содержанием амин ного азота 90-220 мг Х Остальное

2. Способ по п. 1 о т л и ч а юшийся тем, что после осаадения концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного раствора и сорбционной очистке на фосфате кальция.

1147749

Изобретение относится к технологии получения микробных ферментов и может быть использовано для получения препаратов стрептокиназы медицинского и вереринарного назначения. 5

Цель изобретения - уменьшение расхода пищевого сырья и снижение себестоимости целевого продукта.

Цель достигается тем, что соглас10 но способу получения стретокиназы в качестве продуцента используют штамм Streptococcus eguisimilis

921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде „ в которую дополнительно вводят гидролиэат казеи15 на, с содержанием аминного азота 90. 220 мг 7., а также двузамещенный фос, форнокислый натрий и сериокислый натрий при соотношении компонентов, мас.Ж:

Глюкоза 0,4-0,9

Двузамещенный форсфорнокислый натрий О, 1-034

Сернокислый магний 0,01 -0,02

Бикарбонат калия 1,0-1,2

Гидролизат казеина с содержанием аминного азота

90-220 мг 7. Остальное 30

После осаждения концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного раствора и сорбционной очистке на фосфате кальция. и р и м е р 1. Производственный 35 штамм Streptococcus eguisimilis

921/18-77 засевают на агар с 5 вес.X крови барана и помещают в термостат при 36 С на 18 ч. Затем, не допуская о охлаждения культуры, ее смывают 40 с агара казенновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6 ч, приго-товляя таким образом посевной мате.риал . 45

Казеиновую питательную среду для смыва и культивирования продуцента стрептокиназы готовят из ланкреотического гидропизата каэеина, содержащего 800 мг Х аминного азота. Этот 50 гидролизат разводят, внося в 371 л апирогенной дистиллированной воды

89 л гидролиэата, после чего кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины 55 типа ФС-1 и стерилизуют при 116 С.

0 в течение 30 мин. После охлаждения о до 36 С в разведенный гидролизат добавляют при перемешиванин стерильные ингредиенты: глюкозу, двуэамещенный фосфорнокнслый натрий, сернокислый магний и бикарбонат калия до

-получения среды следующего состава, мас.7:

Глюкоза 0,5

Бикарбонат калия 1,0

Двуэамещенный фосфат натрия 0,2

Сульфат магния 0,01

Гидролизат казеина, разведенный до содержания аминного азота 142 мг Е Остальное

Посевной материал в объеме 40 л вводят в ферментер с 500 л приготовленной питательной среды. Культивирование осуществляют под контролем рН.

Стадию культивирования осуществляют в течение 5,5 ч. 3а это время рН снижается до 6,8.

Культуральную жидкость освобождают от микробной массы центрифугированием при факторе разделения 4000

Получают осветленную культуральную

f жидкость в объеме 520 л с активностью стрептокиназы 11000 ед/мл и содержанием побочных ферментов (стрептолизина) 128 ед/мл.

Концентрацию водородных ионов доводят добавлением в осветленную культуральную жидкость ледяной уксусной кислоты до рН. 6,5, после чего производят осаждение стрептокиназы при температуре -7 С этанолом из рас о чета. концентрации последнего в смеси

42 об.X. Операцию первого осаждения проводят в течение 5 ч. Затем отделяют осадок центрифугированием при факторе разделения F 1500 и температуо ре -5 С в течение 20 мин. Для извлечения стрептокииазы осадок растворяют в физиологическом растворе, забуференном до рН 7,8. При этом объем физиологического раствора берут равным 26 л. !

Во время выполнения операции первого осаждения рН при введении этанола повышается до 6,9, а по истечении часа достигает ранее установленного уровня 6,5.

Нерастворившееся в эабуференном физиологическом растворе компоненты отделяют центрифугированнем при

Р 1500 в течение 20 мин при комнатной температуре.

Пример 2. Производственный штамм Streptococcus eguisimilis

921/18-77 засевают на агар с 5 вес.% крови барана и помещают в термостат при температуре 37 С на 20 ч. Затем, о не допуская охлаждения культуры, ее смывают с агара казенновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6 ч, О приготовляя таким образом посевной материал.

Казеиновую питательную среду для смыва и культивирования продуцента стректокинаэы готовят из панкреати5 ческого гидролизата казеина, содержащего 900 мг % аминного азота. Этот гидролизат разводят, внося в 100 л апирогенной дистиллированной воды

10,3 л гидролизата, после чего

0 кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФС-1 и стерилизуют при 116 С о в течение 30 мин. После охлаждения о до 37 С s разведенный гидролизат

5 казеина добавляют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний и бикарбонат калия до получения среды следующего состава, мас.Х:

Глюкоза 0,9.

Двузамещенный фосфат натрия 0,3

Сульфат магния 0,015

Бикарбонат калия 1,2

Гидролизат каэеина до содержания аминного азота 103 мгХ Остальное

Приготовленный посевной материал в объеме 8 л,вводят в ферментер с 112 л вьппеуказанной питательной среды. Операцию культивирования продуцента осуществляют при 36 С в течение 5 ч в периодическом режиме под контролем рН. При этом, начиная со 2-Fo часа культивирования, осуществляют импульсное перемешивание микробной взвеси. За время культивирования происходит снижение рН до 6,3.

Культуральную жидкость осветляют центрифугированием при факторе разделения F 4500, после чего производят фильтрование ее сначала через асбестовую пластину Ф-ЗОО, а затем через миллипоровую мембрану с размером пор 0,22 мкм. Получают ферментсодержащий раствор с активностью

3 1147749

Далее производят второе осаждение стрептокиназы при рН 4,9 (т.е, в-изо электрической точке) и следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси — 43 об. %; температура осаждения — минус 11 С; время осажо дения — 2,5 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при

F 1500 и температуре -5 С в течение о

20 мин. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 1,8 л 0,0158 M фосфатного буферного раствора. Нерастворившиеся компоненты удаляют.

После выполнения данной операции получают l,8 л концентрата, активность стрептокиназы в котором равна 241000 ед/мп, а стрептолизина — 5 12 ед/мл. Следовательно, выход стрептокиназы после второго осаждения составляет 2

241000х1 Ох10 т -х 100%-=7 6Х.

1 1 000х 5 20х 1 О о о

Концентрат вносят в -целлофановые мешки (3 мешка по 600 мл) и диализуют в них против 100-кратного объе- 2 ма 0,0158 М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при о температуре 612 С. В результате диалиэа стандартизируется солевой сос1 тав концентрата и происходит освобождение от оставшихся солей питательной среды.

Концентрат очищают от стрептолизина и пигментирующих веществ сорбцией на фосфате кальция. Для проведения Э5 операции сорбции предварительно готовят гель фосфата кальция путем смешивания 450 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2} с 225 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция с последующей 40 трехкратной отмывкой геля фосфата кальция 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийся гель наносят 1,8 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин 45 при комнатной температуре. После этого ферментный раствор отделяют центрифугированием в течение 20 мин при

F 1500.

В результате получают концентрат 50 стрептокиназы в объеме 1,8 л с активностью 125000 ед/мл, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ

Выход стрептокиназы после сорбци- 55 .онной очистки составляет

125000х1 Зх10

ООООх520х1О х100%=3,9%.

Та блица 1 трептониназа, ед/мл

1760

Выходные параиетры

Режимные параметры so+ вес.7.

Кислот- ОптнчесаР0< ест люка а, ес.X ность, кая плот ед. рН ность

1 80 07 04

2 . 150 05 02

0,017 8, 1

0,010 7,8

0,16

0,40

10000

3 150 05 02

0,010 7,3

0 35

6390

В 114774 стрептокиназы 7520 ед/мл, стрептоли-назы — 128 ед/мл в объеме 110 л.

Концентрацию водородных ионов в фериентном растворе доводят добавлением ледяной уксусной кислоты 5 до 6,3, после чего производят первое осаждение стрептокииазы обработкой данного раствора 40 об.Ж этанола при температуре -8 С в течение 4 ч, При введении этанола до вышеуказанной 16 концентрации его в смеси рй.повышается до 6,7, а но истечении часа достигает 6,4. Затем отделяют осадок центрифугированием сиеси в течение

20.иин при Р 1500 и температуре -5 С. 15

Для извлечения стрептокиназы осадок растваряют в 5 л 0,0158 И фосфатного буферного раствора, Нерастворившиеся компоненты удаляют.

Далее производят второе осаждение 20 стрвптокиназы при рН 4,9, т.е. в изозлектрической точке, при следующих режимных параметрах: количество зтанола s смеси — 40.об.Х; температура

-Ю С; длительность второго осажде- 25 ния - 3 ч. Образовавшийся осадок отделяют цеитрифугированиеи при

Р 1500 и температуре -5 C s течение 20 шин. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 0,4 л 0,0158И ЗО, Фосфатного буферного раствора. Нерастворившиеся компоненты удаляют.

После выполнения данной операции получают 0,4 л концентрата с актив,ностью стрептокнназы 430000 ед/мл; а стрептолнзина †.512 ед/мл. Поэтому выход стрептокиназы после 2-го осаждения равен

« — — -а — — - х100Ж*20,8Х.

4300ООхО 4х10

7526110 Ю,0

Концентрат вносят s целлофановый

;мешок н диализуют против 40 л 0,0158 И фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 6-+2 С.

Для проведения операции сорбционной очистки предварительно готовят гель фосфата кальция путем смешивания 100 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 50 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция с последующей трехкратной отмывкой геля фосфата кальция 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийся гель фосфата кальция наносят 0,4 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. После этого фериентный раствор отделяют центрифугированием в течение 20 мин при F 1500.

В результате получают концентрат стрептокиназы в объеме 0,4 л с активностью 196500 ед/мл, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ.

Выход стрептэкиназы после сорбционной очистки составляет

196500х0 4х10

7520х110х10

В табл. 1 показано культивирование Streptococcus еяжсиыЫв

921/18-77 в казеиновой питательной среде при различных режимных параметрах.

В табл. 2 представлен выход стрептониназы по стадиям технологического процесса.

Для установления оптимального режима получения стрептокиназы принимают во внимание не только количество фермента, накопленное на стадии культивирования, но учитывают также потери целевого продукта на последующих стадиях технологического процес.са, которые, как представлено в табл.2 зависят от условий культивирования.

i 14 7? 49

ПРодлжение табл ) Выходные параметры

Режимные параметры маэ К

+SORY Кислот- Оптнчесес.X н о с т ь, кая плот ед. рН ность

Амин

ЯИЙ азот мгй трептонинаэа, д/мл лвко аэ ес.I

0,35

7500

4590

0,28

0,40

6885

0,006

8,1

0,27

0,47

9370

9 220 0,5 0,2

10 200 0 8 0 2

0,26

5105

6130

0;30

11 100 0 9 0 3

8,0

0,014

4950

0,33

3140

0,020 8,0

12 90 0,6 0,4

0,24

Таблица 2

Выход стрептокиназы в Ж к ее содержанию в бульонной культуре

Режим, N

П осаждение осаждение

20 5

4,9

1,78

30,6

4,95

12,6

57,9

6,50

17,6

Составитель Е.Воробьева

Редактор В.Ковтун ТехредМ.Гергель Корректор Н.Король

Заказ 1500/25 . Тираж 525 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППИ "Патент", r.Óàrîðîä, ул.Проектная, 4

200 0,7 0,4

140 0,4 0,4

140 06 01

140 06 03

140 06 03

0 017 8,1

0,017 8,1

0,017 8,1

0,015 7,4

0,012 7,8

0,010 7,7