Галогеноалкилпроизводные 7-окси-5,6-бензо- @ -пирона в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминосоединений

 

Галогеноалкнппроизводные 7-ок-си-5 ,6-бензо-ed-пирона общей формулы где при R,- -(он 2), водород или метип или при R,-(СН ) Вг, RJ - метил,g в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминосоединений . 4 СО О1 со Од

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСОУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

R30 нии в

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ ЩЙ (2 1) 3639809/23-04 (22) 07.07.83 (46) 15.12.85. Вюл. N 46 (71) Институт токсикологии Министерства, здравоохранения СССР (72) А.Ç.Абышев, В.Г.Климов, С.С.Крылов, И.П.Сидорова и В.В.Яковлев (53) 547.812.5.07{088,8). (56) Ma|ik М.S., Rastogi S.N. Indian

7. Chem., 1981, v.20Â, 11 6, р.171174.

Goodwin R.Í., Kavanagh P. Arch..

Bioch., 1950, ч.27, У 1, р.152-173.

Stewart J.Т., Lotti D.M., Апо1.

Chem, Acta., 1970, ч.52, М 2, р.390393, Stewart J.Т., Lotti D.М., J.Pharm.

Sci, 1971, v.60, М 3, р.461-463.

Turk J, gneiss S.J., Davis J.Е., е . а1. Prostagland,, 1978, v,16, р.291-309.

Алексеев С.М., Помойиицкий В.Д., Сарычева И,К., Евстигнеева P.Ï., Хим. фарм. ж., 1981, I 11, с. 115-1!8.

„.SU„„1149596 А

З15!1 С 07 D 311/16 G 01 N 31/22 (54 ) ГАЛОГЕНОАЛКИППРОИЗ ВОДНЫЕ 7-ОКСИ-5,6-БЕНЗО- а-ПИРОНА В КАЧЕСТВЕ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ТРЕТИЧНЫХ АМИНОСОЕДИНЕНИЙ. (57) Галогеноалкилпроизводные 7-ок-. си-5,6-бензо- в -пирона общей формулы

rye при R>- -(СН 2)ЗСХ, Н2 водород или метил или при R (СН ) Вг, R — метил, в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминосоедине!

149596 лы (1) 8 0 О 0

R10 сн

40 он о

ОН

О (v) (v>) 45 снег

55 о о (1Y) Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к галогеноалкилпроизводным 7-окси5,6-бензо- ot. — пирона общей формугде при В --(CH>)3C2, R2 — водород или метил или при R, --(CH ) Br, R2 метил, в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминосоединений.

Соединения формулы (1) обладают высокой флуоресценцией и содержат достаточно реакционноспособные функциональные группы, что позволяет испольэовать их в качестве флуоресцентных меток для количественного флуорометрического определения различных лекарственных препаратов и токсических веществ в объектах судебно-медицинской экспертизы и в водных растворах.

Известен 4-метил-8-ацетил-7-(3 хлорпропокси)-5,6-бензо- I-пирон формулы (П) О-СН;СН,— СН,-С1 со-сн, Однако соединение формулы П имеет слабую флуоресценцию (чувствительность определения 10 мг/мл).

Известны также в качестве флуоресцентных реагентов некоторые. производные 5,6-бензо- 4 пирона, в частности 7-окси-3-карбокси-5,6с -пирон формулы (Щ) чувствительность определения 10 4мг/мл и 7-метокси-4-бромметил-5,6-бензос -пирон формулы (1У) (чувствительность определения 10 5мг/мл), на основе которых разработаны спектрофлуорометрические методы количественного определения производных амфетамина и простагландинов

СООН

Н0 0 О НС0

Недостатком известных соединений формул (Ш) и (1Ó) является то, что они имеют слабую флуоресценцию— чувствительность определения до

5 10-9 мг/мл.

Целью изобретения является изыскание новых реакционных галогеноалкилпроизводных 7-окси-5,6-бенэо-апирона, обладающих свойством прида- вать третичным аминосоединениям повышенную фпуоресценцию.

Цель достигается использованием в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминосоединений галогеноалкилпроизводных 7-окси-5,6-бензо- о -пирона общей формулы (1) где при В„--(СН, sCl., В,— водород

25 или метил или при R -- СН2 2Br

В2 — метил.

Соединения формулы (1) получают путем взаимодействия умбеллиферона (V, R„-Н) или 4-метилумбеЛлиферона

ЗО (1 ° В„-CH3) с Н< ОМ»<Но> или

1„3-хлорбромпропаном в среде абсолютно сухого органического растворителя, такого, как ацетон, в присутствии К2СО5, при температуре кипения реакционной смеси.

Соединения формулы (1) обладают высокой флуоресценцией (чувствительность определения до 10 ""мг/мл), причем последняя зависит от строения и расположения заместителей в ядре 5,6-бензо-Ы -пирона. Реакция их синтеза протекает всего в одну стадию, основана на использовании доступных реагентов, технологически проста и открывает возможность расширения числа флуоресцентных реагентов, применяемых в спектрофлуорометрии.

Получение соединений формулы иллюстрируется примерами 1 -3.

Т а 6 л и ц а

Фиэикопиинческие ларактернстикн производнык 7-окси-5,6беизой-пирона формула I Сое вен иев

}}ИР-спектр (НХ-90, в С}}С!

ГИДС), д", м,д, ИХ-спектр, см- айден

6,18, 7,58/д,, 3 - 9,5 Гц, Н Э и Н 4/, 6э77э 7э33 (д1 3 - 9 Гц, Н-б н Н-5/, 6,73/с, Н-&/, 2,20 /к, 3 11 Гц, 3 * 6 Гц, -СН -/, 3,62, 4 ° 1!/т, .3 7 Гц -СН -С! н -СН -0- соответственно/

1720/С 0 а -пирона/, 1675, 1550, 1510 /-СН СН-связь в ароматическом кольце/

С 60,32}

60,7}

Н 49909

5,01

Ct 14,65;

}5 ОО

С 60,50

Н 4,62

С3 14,70 е .

С 52,65;

52,55

Н 4,1}

4,35

1720/СОа}"пирона/ °

}675 1560

}515/-СН СН-связь в ароматическом кольце/

С 52174

6,05 /c,H-Э(, 6,79, 7,38/д, 3 9 Гц

Н-6 и Н-5/, 6,72 /с,Н 8/

3,6}, 4,27 /т, 3 7 Гц, -0-СНй-СНт-Вч(, 2,34 /с, - С-СНз/

И 4 0

Вч 29 в 15 Вч 29 э 34

6,60 (с, Н-3/, 6,73; 7,38 /д. 3

9 Гц, Н-6 н Н-5/, 6,67 /с, Н-&/, 31,71 э 4э}1 /тэ 7 7 ° 5 Гце -СНд-Ct н -.СЙ -0- соответотвенно/

2,25 /к, J 11 Гц, 1 6 Гц,.

-СНт-/, 2,3} /с, С-СНз/

С 6},90

}715 /С 0 ot.-mpo на(, 1680, }650, 1530, 1510 /-СН СНs ароматическом кольце/

С 61,65;

61, 79

Н 5,}5;

4, 95

CR }4 О

Н 5,15

C l } 3,80

3 :.11495

Пример 1. 7-(3 -Хлорпропокси)-5,6-бензо- а -пирон (В„-|(СН,) CL;

R . Н)..16,2 г умбеллиферона. раста воряют в 150 мл,ацетона, добавляют

15 мл 1,3-хлорбромпропана и 14 г

К CO . Реакционную смесь помещают в круглодонную колбу, которую соединяют с обратным холодильником, и кипятят в течение 24 ч, Затем фильтруют, растворитель концентрируют 10 до небольшого объема и хроматогра- . фируют на колонке (5хl50 см) с нейтральной окисью алюминия (800 r акт. П ст.). Элюирование проводят смесью хлороформа и петролейного !5 ( эфира. Получают 7-(3 -хлорпропок-. си)-5,6-бензо- с -пирон состава

СД 03CL, т.пл. 107-109 С (из бензола) с выходом 7,0 r (31 ).

Пример 2. 4-Метил-7-(2 -бром-20 ( этокси)-5,6-бензо- о -пирон

fR >- (CH ) 2 Вг, R < -Сн ).

17,6 г 4-метнлумбеллиферона растворяют в 150 мл ацетона, добавляют

96 4

18 мл дибромэтана и 14 г К СО . Далее процесс ведут, как в примере 1.

Получают 4-метил-7-(2 - бромэтокси)5,6-бензо- ñ4-пирон состава С Н 03Вг, т. пл. 106-106,5 С (из бензола). Вы-. ход 13 r (46X)

Пример 3. 4-Метил-7-(3--хлорпропокси)-5,6-бензо-o/ -пирон (Rq(С 4 С 1 .-Снз ).

17,6 r. 4-метипумбеллиферона растворяют в 150 мл ацетона, добавляют

15 мл 1,3-хлорбромпропана и 14 r

К СО . Далее процесс ведут, как в примере 1. Получают 4-метил-7«(3 хлорпропокси)-5,6-бензо- 4-пирон состава С, Н О СХ, т. пл. 79-80 С (из бенэола) с выходом 12 г (53X).

Соединения формулы - кристаллические вещества белого цвета, растворимй в хлороформе, спирте, ацетоне, бензоле, нерастворимы в воде, их химико-физические характеристики приведены в табл. l.

1149596 цик3тозила, глипина и их аналогами, образуют соответствующие кватернизованные соединения

5 (УП-1Х). с"4

+I

ОСН2-СН2 СН;й-СН2-СН;О-СН О С1СНЗ

ЮИ сн> ОН

+I I

0-СН2-СН2 — 5- СН2-СН -О-СО-С ! сн, 0ЛП) 0-СН2 — СН2-Снг-Ж-СН3-Сиг СН-О-Со-С С1СН СН

2 (1X)!

Полученные . модифицированные соединения (УП-1Х) обладают флуоресценцией с идентичными реагентами формулы (1) спектрами возбуждения и эмиссии: 324 и 410 нм. Поэтому при

35 использовании предлагаемых соединений в качестве, флуоресцентной-метки требуется отделение избытка данных реагентов от продуктов реакции

Чувствительность, мг/мл

10 ""

Соединение формулы 1 г)З (СМ зС " С" Ю

l0

-п

R,--(CH ) Вг; Н - СН>

Соединения формулы 1 при взаимодействии с различными нефлуоресцирующими,третичными аминосоединениями, например с,.основаниями димедролаз

Использование соединений форму-, лы 1 в качестве флуоресцентной метки для определения третичных аминов (циклозина, димедрола и липина) показано в примерах 4-7.

Пример -4. Бромид-4-метил-7(2 -Н-диметилэтилфенилциклопентилгли-! колат)-этокси-5,6-бензо- k-пирона (УШ).

0,2 r 4-метил-7-(2 -бромэтокси)5,6"бензо- о -пирона растворяют в при помощи метода хроМаТографин.

Таким образом, можно с очень высокой чувствительностью измерять собственную флуоресценцию полученных соединений (УШ-1Х).

Ниже приведены данные о чувствительности определения соединений формулы 1.

15 мл сухого ацетона, добавляют 0,2 г основания циклозила и реакционную смесь, помещенную в круглодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, нагревают 6 ч о при 56-58 С, после чего оставляют при комнатной температуре на сутки. При этом выпадают кристаллы, которые отфильтровывают и дважды промывают горячим ацетоном. Полунают кватернизованное соединение

1149596

Пример 6. Хлорид 4-метил-7(3 -тропинилбензилат)-пропокси-5,6бензо- а -пирона (IX).

0 72 г 4-метил-7-(3 -хлорпропокУ си)-5,6-бензо- о! †.пирона растворяют в 25 мл сухого ацетона, добавляют

0,70 r глипина. Далее процесс ведут как в примере 4. Получают кватернизованное соединение (IK) состава

° °

H Q NCJ, т.пл. 171-173 С. Выход ,72 г (43%) (физико-химические характеристики кватернизованных соединений УП-1Х приведены в табл.2).

Таблица2

Соеди нение форФЩВЫ

IIFIP-спектр (НХ-90, в CIVIC II>

0-ГИДС1, м,д, 6 ° 20, 7,50 /д, S 10 r Н-3

Н-4/, 6 80, 7,45 /д, ую 9 Гц

Н-6 и Н-5/, 6,70 /c, Н-8/, 4 50

3,50 /с, -й-СН /, 7е,20 /м,фенильные кольца

l725/СО а -пирона/, 1680, 1570, !520

/-СН=СН- связь в ароматических кольцах/

С 70,58

6,49

У!1 С. 70,72

Н 6,35 и 2,89

С! 7 ° 20

FI 2,83

Cl 7,0

3450/OH/, 17201745/C0o(-пирона и сложноэфирной группировки/, 1675, !

659, 15I5 /-СН"СНсвязь в ароматическом кольце/

С 69,08 С 69,38 3580/-ОН/, 1730, Н 6 !2 Н 5 95 !745 /С 0 Й-пирона и сложноэфирной и 2,60 H 2,38 группировки/, !650, С! 5 72 CI 5,95 1570 ° 1510/-СН СНсвязь в ароматических кольцак/ сят в круглодонную колбу на 150 мп и отгоняют растворитель под вакуумом досуха. В колбу с экстрактом добавляют 1 мл стандартного раствора (концентрация 0,1 мг/мл) одного из флуоресцентных реагентов формулы (УП) в сухом ацетоне. Объем доводят до 5 мл сухим ацетоном и реакционную смесь термостатируют при 56-58 С в течение 1 ч в темноте (при этом реакция протекает количественно ), после чего ацетон упаривают под вакуумом досуха и остаток растворяют в 0,5-1 мл этанола. 100 мкл полученного раствора (Уй) состава С,зН...О ИВг, т.пл. 154155 С. Выход 0,15 г (39X).

Пример 5. Хлорид 7-(3 -Nдиметилэтилбензгидрил)-пропокси 5,6-бензо- а -пирона (УП).

0,4 r 7-(3 -хлорпропокси)-5,6бензо- И-пирона растворяют в 50 мл сухого ацетона, добавляют 0,5 г основания димедрола. Далее процесс ведут, как в примере 4. Получают кватернизованное соединение (уП) о состава Ц, 1 О NCX, т.пл. 192-193 C.

Выход 0,6 г (777).

Найдено, Х Вычис- ИК-спектр,см лено,X

У! I l С 62 ° 24 С 62э14, Н 6,25 Н. 6,42

H 262 Н 250

Вч !4,4 Вч 14,28

Пример 7. Качественное и количественное определение димедрола, циклозила и глипина с использованием соединений формулы УП.

Для идентификации и последующего определения количества исследуемых аминосоединений в воде и биосредах необходимые объекты экспертизы помещают в соответствующую делитель,ную воронку, рН среды доводят до

10-11 1 н. раствором натриевой щелочи, перемешивают и немедленно экстрагируют хлороформом трижды по

30 мл в течение 2-3 мин. Хлороформйые извлечения объединяют, перено6,09/с, Н-3/, 6,80, 7,42 /д,,7

9 Гц, Н-6 и Н-5/, 6,90 /c, Н-8/, 4,30 /м, -0-ССН -/, 3,52-4,15

/м, -WFI>/, 3,30 /с,. -Й-СН / °

7, l0/ñ, Фенильная группа/, 2,25 /и, циклопектильная группа/, 2,40 /с, С-СНз/.

6,20 /с, Н-3/, 6 ° 79, 7,45 /д, 3

8 Гц, k-6 и Н-5/, 6,85/с, Н-8/, 5,!О /с, - Н-О-CO/s 4,50 /м, -0-СН,-, -И- СН,-/, 3,35 /c.

-A-CII /, 2,40 /с, С-СНэ/, 2, 2

/и, - СН - в бициклической части молекулы, 7,!2 /м, феннльная группа/

1!49596

1 -10 1 -10

1 10

9 -10

Найдено, мг/мл с помощью микропипетки наносят на стартовую линию (!,5 см от нижнего края) пластины силуфол (20 смх х20 см). После улетучивания ра5 створителя в местах нанесения проб хроматограмиу помещают в предварительно (10-15 мин) насыщенную камеру с системой метанол-НСХ в соотношении I 0,05. Нижний край пласти- !0 ны погружают в систему растворителей примерно на 1 см так, чтобы уровень растворителя был ниже стартовой линии. Когда фронт растворителя находится на расстоянии 0,5 см от верхнего края пластины,. ее извлекают из камеры и отмечают линию фронта. Хроматограмму сушат в вытяжном шкафу в течение 5-!0 мин, затем обнаруживают пятна, рассматривая хро- 20 матограмму в УФ-свете. При этом кватернизованные соединения (Х-ХП) проявляются в виде ярко-голубых пятен со следующими значениями R .ÓÏ 0,43

УШ=0,38, !Х=0,50, что позволяет иден- 25 тифнцировать их среди. многочисленных природных соединений, содержащихся в исследуемых объектах экспер- тизы. После этого соответствующие пятна обводят, вырезают и.вещества 30 смывают с пластины в мерную колбу на

25 мл трижды по 5 мл дистиллированной водой через.,складчатый бумажный

Растворено циклозила, мг/мл

Результаты определения димедрола в сыворотке крови кроликов (опыты in vivo) с применением 7-(3— хлоропропокси)-5,б-бензо- ot-пирона (1). 45

Доза димедрола,мг/кг Найдено,мг/мл

30 3 10

Определение димедрола производят через 30 мин после внутрибрюшинного введения препарата цельному живот- 50 ному °

Результаты определения глипина в сыворотке крови крыс (опыты п п .— чо) с применением 4-метил-7-(3 "хлорпропокси)-5,б-бензо- Ы -пиро- 55 на (3).

Доза глипина;мг/кг Найдено,мг/мп

10 8 10"5 фильтр. Объем доводят до .метки, перемешивают и флуоресценцию раствора измеряют, например на спектрофлуорометре фирмы "Hitachi MPF-2A" при длине волны 4)0 нм, возбуждая свечение светом длиной волны 324 нм.

Количественное содержание исследуемых соединений определяют по калибровочным графикам или методом сравнения интенсивности флуоресценций стандартных растворов кватернизован-. ных соединений (УП-1Х) с таковыми изучаемых проб.

Минимальное визуально открываемое в пробе (в пятне на пластине) количество вещества при использовании для хроматографии пластин — силуфол в системе метанол-НСР (1:0,05) и при освещении ультрафиолетовьйч осветителем типа "ВИО-I, УФС-2" равно для циклозила !О мг (из воды), для димедрола 10 1мг (in vivo, иэ сыворотки крови кролика), для глипина

l0 Mr (in vivo, из сыворотки крови и из печени Kpbic)> что иллюстрируется приведенными ниже данными.

Результаты определения циклозила в

I воде с применением 4-метил-7-(2— бромэтокси)-5,6-бензо- с(-пирона (2) (приведенные здесь и далее данные являются средними из 5 измерений),.

9 !О 8 10 8 10

Определение глипина производят через 30 мин после внутрибрюшинного .. введения препарата цельному животному.

Соединения формулы (Г) и разработанный на нх основе спектрофлуорометрический метод качественного н количественного определения различных лекарственных препаратов и токсических веществ могут найти применение дпя микроаналитических исследований в области фармако- и токсикокинетики, s контроле за производством лекарственных препаратов, при решении задач судебно-медицинской экспертизы.

Соединения формулы (Г) обладают повьппенной чувствительностью по срав1149596

Составитель С.Полякова

Редактор П.Горькова Техред С.Мигунова Корректор Е.Сирохман

Заказ 8129/2 Тираж 383 . . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 нению с известными веществами, применяемыми для этой же цели (1.0 "110 1 мг/мп против 10 мг/мл соответl ственно, при нх использовании в качестве флуоресцентной мет ки.