Способ получения монаколина @ ,обладающего антигиперхолестеримическим действием

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНАКОЛЙНА К,, ОБЛДЦАЮЛСЕГО АНТИПШЕРХОЛЕСТЕРИМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ общей формулы НО. о заключающийся в том, что Monascus ruber 1005 (FERM - Р4822) выращиваютв питательной среде, cor держащей источник азота, углерода и минеральные соли, в аэробных условиях при 20г35лС ,с. последующим вьзделением целевого продукта из,купьтуральной жидкости. со CZ ел 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (t9) 03) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2887300/28-. 13 (22) 20.02.80. (31) 17856/79 (32) 20.02. 79 (33) Япония (46) 23.05.85. Бюл. № 1 9 (72) Акира Эндо (Япония) (71) Санкио Компани Лимитед (Япония) (53) 615.779.90(088.8) (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНАКОЛИНА К, ОБЛАДАЮЩЕ ГО АНТИГИПЕРХОЛЕСТЕРИМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ общей формулы

Н0 О

4(51) С )2 Р 7/00// (С 12 P 7 /00, С 12 К 1/00) заключающийся в том, что штамм

Monascus ruber 1005 (FERN — Р4822) выращивают в питательной среде, со-,, держащей источник азота, углерода и минеральные соли, в аэробных условиях при 20-,35::С:.с последующим выделением целевоГо продукта из,культуральной жидкости.

1158048

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового препарата, обладающего антигиперхолестерими ческим действием. 5 .Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено.

Цель изобретения — создание способа получения монаколина К.

Цель достигается тем, что согласно 10 способу получения монаколина К, обладающего антигиперхолестеримическим двйствием, общей формулы

НО

Ц штамм Monascus ruber 1005 (PERM—

Р4822) выращивают в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, в азробных условиях-при 20-35ОС с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости.

Способ получения манаколина К предусматривает использование штамма

Monascus ruber 1005. Штамм выделен из пищевых продуктов„ изготовленных в

Таиланде в 1979 г.

Штамм Monascus.ruber 1005 хранится в коллекции Научно-исследовательского института проблем ферментации под регистрационным номером FRRM — Р4822 и характеризуется следующими культу40 рально-морфологическими и физиологобиохимическими признаками.

Рост на картофельно-глюкозно-агао роной среде при 25 С быстрый и диаметр колонии достигает 6-6,5 см 4$ спустя 10 сут после инокуляции. Колония плоская и развивает относительно тонкий базальный слой гиф. Развитие воздушных гиф слабое; воздушные гифы белые и большинство из них опущены. 50

На базальном слое гиф образует множество клейстотеций и по мере созревания становится красновато-коричневым. Поверхность и нижняя сторона колонии по цвету от коричневой до 55 красновато-коричневой.

Рост на агаровой среде Сабуро (Sabouraud) при 25 С очень быстрый и диаметр колонии достигает 6-6,5 см смустя 10 сут после инокуляции. Поверхность колонии очень плоская и базальные и воздушные гифы развиваются лучше, чем на картофельно-глюкозно-агаровой среде. Число клейстотеций весьма немногочисленно.,Поверхность колонии по цвету от красноватожелтой до красновато-коричневой, а обратная сторона — от красноватокоричневой до темно-коричневой.

Рост на агаре на отваре из овсяной муки при 25 С медленный и диаметр колонии достигает 1,5-2 см спустя

10 сут после инокуляции. Колония плос-. кая. Развитие воздушных гиф и обра-. зование клейстотеций весьма слабое.Поверхность и обратная сторона колонии по цвету от темно-красной до красновато-коричневой.

Рост на среде Чапека при 25 С очень медленный и диаметр колонии достигает 1,6-1,8 см спустя 10 сут после инокуляции.

Скорости роста на каждой из приве" денных сред при 37 С по существу равны скоростям при 25ОC.

Клейстотеции сферические, диаметр

30-60 мкм; стенки клейстотеций тонкие, и пленчатые; их ножки имеют чашелистиковые стенки и каждая состоит из. гифы диаметром 3,5-4,5 мкм и длиной

15-80 мкм, Сумка состоит из восьми опор и приблизительно сферическая и быстро исчезающая. Аскоспоры бесцветны и имеют яйцеобразную или овальную форму; размер 4-5х4-7 мкм; поверхности гладкие. Конидии бесцветные и сферические или грушеобразные, размер 6-9х6-11 мкм; их основания плоские, стенки относительно толстые и гладкие. Конидии связаны вместе своими основаниями. Конидиеносцы подобны вегетативным гифам и являются разветвленными или неразветвленными, причем конидии образованы на вершине. Иицелий бесцветный и разветвленный и имеет чашелистиковые стенки; большинство из них имеет диаметр 3-5 мкм.

Способ осуществляют следующим образом.

Ионаколин К может быть получен культивацией выбранного микроорганизма в культуральном бульоне в азробных условиях с применением известных методов для культивации грибов и других микроорганизмов. Напри;

11580

3 мер, продуцирующий монаколин К микроорганизм может быть вначале культивирован на подходящей, среде, а затем полученные микроорганизмы могут быть собраны и использованы для инокуляции и культивированы на другой культуральной среде для нарабатывания требуемого монаколина К; культуральные среды, используемые для размножения микроорганизма и для 1б нарабатывания минаколина К, могут быть идентичными или равными.

Может использоваться любая извест ная культуральная среда, пригодная для культивации грибов, при условии, что она содержит необходимые питательные материалы, особенно источник усваиваемого углерода и источник усваиваемого азота. Примерами подходящих источников усваиваемого углерода являются глюкоза, мальтоза, .декстрин, крахмал, лактоза, саха: роза и глицерин, из которых пред-. почтительны для .производства монаколина К глюкоза, глицерин и крахмал.

Примерами подходящих источников усваиваемого азота являются пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, соевая мука, арахисовая мука, жидкость после замачивания кукурузы, рисовые отруби и неорганические источники азота, из которых предпочтителен пептон. При производстве монаколина К неорганическая соль и/или соль металла могут быть, 3S если это необходимо, добавлены к культуральной среде. Кроме того, если требуется, может быть добавлено небольшое количество тяжелого металла.

Микроорганизм предпочтительно культивируют в аэробных условиях с использованием известных методов культивации, например, твердой культуры, встряхиваемой культуры или культуры в условиях аэрации и перемешивания. Микроорганизм растет в широком температурном диапазоне, например 7-40 С, но с точки зрения производства монаколина К более предпочтительна температура культивации

20-30 С.

48 4 тов. Культивация может быть затем продолжена до накопления в культуральной среде существенного количества монаколина К, после чего монаколин К может быть выделен и извлечен из культурального бульона с помощью любой подходящей комбинации методик выделения, выбранных с учетом его физических и химических свойств.

Например, возможно применение любого или всех нижеследующих методов выделе. ния: экстракция раствора из культурального бульона гидрофильным растворителем (например, диэтиловым эфиром, этилацетатом, хлороформом или бензолом); экстракция oprcLHHsMR гидрофильным растворителем (таким как ацетон или спирт); концентрирование; растворение в более полярном растворителе (например, ацетон или спирт); удаление примесей менее полярным растворителем (таким как петролейный эфир или гексан); гель-фильтрация через колонку с таким материалом как сефадекс; абсорбционная хроматография с использованием активированного угля или силикагеля, и т.п. Путем применения подходящей комбинации . этих методов требуемый монаколин К может быть выделен из культурального бульона в виде чистого вещества.

Монаколин К, в том Виде как он выделен из культурального бульона

Monascus ruber штамм 1005, характеризуется следующими свойствами (серия А).

Цвет и форма: бесцветные .кристаллы.

Точка плавления: 157-159 С (с разложением) .

Элементарный анализ, 7: С 71,56;

Н 8,85; 0 19,59.

Молекулярная масса: 404 (по данным масс-спектрометрии).

Молекулярная формула: С „ Н . 0 .

УФ-спектр поглощения (метанол): максимумы на 232, 238 и 246 нм.

ИК-спектр поглощения (KB r).

ЯМР-спектр (протонный 60 МГц; в дейтерированном хлороформе с использованием тетраметилсилина в качестве внутреннего стандарта).

Во время культивации микроорганизма нарабатывание монаколина К может контролироваться отборомкультурной М среды и измерением физиологической активности монаколина К в культуральной среде с применением описанных тесЯМР-спектр (" С; в дейтерированном метаноле).

Растворимость: растворим в низших спиртах (например, метаноле, этаноле и пропаноле), ацетоне, хлороформе, 1158048 этилацетате и бензоле. Нерастворим в петролейном эфире и гексане.

Удельное вращение: Ld1, = + 307,6 (с=1, метанол).

Тонкослойная хроматография: 5

Rf = 0,47 (N> 5715 Кизельгель 60 Fzz< силикагель (фирма "Мерк энд Ко."), проявление смесью 4:1 метиленхлоридацетон, детектирование в виде УФ-поглощаемой массы, 50% (o6./îá.) серная 1О кислота (цвет от бледно-красного до красновато-коричневого проявляется при нагревании) или иодом3.

Пример 1. Мопазспз ruber штамм 1005 инокулируют на жидкую культуральную среду, содержащую

6 об.% глюкозы, 2,5 об.% пептона, 0,5 об.% жидкости после замачивания кукурузы и 0,5 .вес./об,% хлорида аммония. Культивацию продолжают в М о аэробных условиях при 28 С в течение

10 сут. Результирующий фильтрат (5 л) культурального бульона доводят до рН 3 добавлением 6 н хлористоводородной кислоты, а затем экстрагируют ?- равным объемом этилацетата. Растворитель из экстракта отгоняют при пониженном давлении и результирующий остаток растворяют в 100 мл бензола.

Нерастворимое вещество отфильтровы- 3Q вают.

Фильтрат pBGKpbl промывают, каждый раз 100 мл 5 вес./об.% водным раствором бикарбоната натрия. Затем к промытому фильтрату добавляют 100 мл

0,2 н водного раствора гидроокиси натрия и смесь перемешивают при комнатной температуре. После подтверждения исчезнования монаколина К из бензольного слоя данными ТСХ отделяют @ водный слой. рН водного слоя затем доводят до рН-3 добавлением 6 н хлористоводородной кислоты и результирующий раствор дважды зкстрагируют, каждый раз 100 мл этилацетата. Экстракт упаривают до сухого остатка при пониженном давлении, получая 260 мг масла.

Монаколин К способен снижать уровень содержания холестерина в крови и печени.

Пример 2. Снижение уровня содержания холестерина в крови и печени крыс.

Используют крыс породы Вистар- 55

Имаь3ити, каждая особь весом около

300 r. Испытания проводят на групйах крыс, каждая группа насчитывает по

5 животных. Каждому животному ык; тривенно делают инъекцию 300 мг/кг

Тритона MR=1339 (товарное наименование для материала, повышающего уровень содержания холестерина в крови) при одновременном введении 10 мг/кг монаколина К либо перорально, либо внутрибрюшинно. Спустя 20 ч после перорального введения или 14 ч после внутрибрюшинного введения крыс умерщвляют путем обескровливания, кровь и печень собирают и обычными методами определяют уровень содержания холестерина в них. В результате установлено, что уровень содержания холестерина в крови ниже по сравнению с контрольной группой животных, которой вводят лишь Тритон MR-1339. на

22,4% в случае перорального введения и на 23,9% в случае внутрибрюшинного введения. Уровень содержания холесте-. рина в печени снижен на 16,7% у животных, которым монаколин К вводят перорально., Пример 3. Снижение уровня содержания холестерина в крови у кроликов.

Используют подопытных животных— кроликов, имеющих вес тела 2,?

2,9 кг. Каждому кролику перорально вводят 1 мг/кг монаколина К дважды в сутки (утром и вечером) непрерывно в течение 5 сут. Перед введением и на третий и пятый день после введения собирают кровь из ушной вены и определяют содержание холестерина в сыворотке крови. В результате получено, что содержание холестерина на третий и пятый день после введения монаколина K на 15 и 29% соответственно ниже уровня до введения минаколина К.

Монаколин К обеспечивает 50%-ное ингибирование биосинтеза холестерина при концентрации 0,002 мкг/мл с помо- . щью эксперимента, в котором уксусную кислоту вводят в реакцию с ферментом из печени крыс. Обнаружено, что Монаколин К ингибирует НМ G-СоА редуктазу, которая является регулирующим скорость ферментом биосинтеза холестерина, и что он конкурентно ингибирует субстратную HN С-СоА и имеет

К, — значение, равное 5,3х10 М.

К; — значение представляет собой константу ингибирования и, более конкретно, константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Зту величину получают умножением концентраций

1158048

Составитель Г. Смирнова

Техред М, Гергель Корректор И.Муска Редактор С. Лыкова

Заказ 3961 подписное

Тираж 525

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фермента и ингибитора с делением на концентрацию комплекса ферментингибитор.

В дополнение к высокоценному ингибиторному эффекту в отношении биосинтеза холестерина монаколин К характеризуется крайне низкой токсичностью. Так, острая пероральная токсичность (LD ) MQHRKQJ1HHR К для мышей составляет 1 г/кг веса тела или еще большую величину.

Монаколин К может быть введен перорально или парэнтерально в виде э капсул, таблеток, препаратов для инъекций или в виде любого другого известного состава.

Таким образом; получают препарат монаколин К, обладающий антигиперхолестеримическнм действием.