Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена

 

СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНО ,ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. АНТИГЕНА, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермент1а, присоединение коньюгата и определение антигена из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце, отличающийс я тем, что, с целью повьшения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве фермента используют неорганическую пирофосфатазу , а в качестве субстрата соль пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-0,5 (Л сд 00 со Сдд СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (и) (51)4 С 01 N 33/535, 33/55!

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

g(Ú / (21) 3697953/30-15 (22) 16.02.84 (46) 07,11.87. Бюл, У 41 (71) МГУ им. М,В.Ломоносова (72) И.Г.Атабеков, С.М.Аваева, А.А.Байков, А.В.Кулинич и О.А.Мизенина (53) 632,938 (088.8) (56) Дзантиев Б.Б., Егоров А.М. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа.—

Всесоюзное химическое общество им, Д.И.Менделеева, 1982, т. 27, N 4, 82-89.

0/Sullivan М.Т. Bridges T.l„, Marks Ч, Enzyme immunoassay . а, reviem. Ann. Clin. Biochem, 1979, 16, 221-240.

Патент США М 3839153, кл. 195-103,5, 1974.

Патент Великобритании 11 1597754, кл, С 1 В, 1979.

Патент США 11 4298686, кл. 4298686, кл. 435-7, 1981.

Lemmel S.À. Mccain А.Н. Morris Т.Y.

Evaluation of indirect enryme-linked

immunosorbent assay for the detection of plant virnses, Phytopathology, 1982, 72, У 8, 1018-1022, (54)(57) СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНО,ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение коньюгата и определение антигена иэ образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве фермента используют неорганическую пирофосфатазу, а в качестве субстрата— соль пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-0,5 мМ. 1

1! 58933

Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано для определения антнгенов в биологических и других объектах.

Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных ферментом, (иммуноферментный анализ) получает все большее распространение 10 благодаря простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными для здоровья веществами. Наиболее широко используется метод гетерогенного иммуно- 16 ферментного анализа, при котором соединение антитела с ферментом (конъю- гат) присоединяют к поверхности твердой фазы. Существующие способы ге» терогенного иммуноферментного анали» 20 за различаются типом фермента, использованного для получения коньюгата. ,Известны способы гетерогенного иммуноферментного анализа антигенов 25 с применением Р -галактозидазы, пероксидаэы, каталазы, глюкозоксидаэы, амилазы и 6 5,3-катостероидизомеразы (1 — 5).

Однако субстраты этих ферментов — 30 .сложные органические соединения, нестойкие при хранении, Визуальный анализ результатов определения при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-эа невысокой интенсивности окраски или высокой величины. фона.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является 40 способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена, включающий получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение коньюгата и определяемого антигеча 45 из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически. В качестве фермента в этом способе используют .щелочную фосфатазу, а в качестве субстрата — инитрофенилфосфат. Для получения конъюгата специфического антитела и щелочной фосфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, пос-. ле чего избыток последнего удаляют диализом или гельфильтрацией. Для присоединения вируса к поверхности твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на несколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуется определить содержание антигена. Последний присоединяется к стенкам сосуда в результате взаимодействия с адсорбированными на ннх специфическими антителами. Затем в сосуд помещают раствор конъюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, в результате чего конъюгат связывается с антигеном в количестве, пропорциональном содержанию последнего в образце.

После этого прибавляют раствор субстрата, и-нитрофенилфосфата и инкубируют с ним. Продукт ферментативной реакции является п-нитрофенол, количество которого измеряют колориметри" чески при 405 нм. При количественном определении используют .калибровочньй график, который получают, беря вместо образца растворы антигена известной концентрации. Качественно присутствие антигена в образце определяют визуально по появлению желтой окраски.

Недостатком способа является невысокая чувствительность, связанная с тем, что продукт. реакции — и-нитрофенол, имеет невысокий коэффициент экстинкции (15000 м см ) и возникающая желтая окраска плохо воспринимается визуально, Допустимый срок хранения субстрата в растворенном виде составляет около 1 недели в твердом виде субстрат заметно разлагается даже при хранении при пониженной температуре, что приводит к возрастанию фона, При определении активности щелочной фосфатазы используют высокую концентрацию субстрата (10 мИ), что связано с высоким значением константы Михаэлиса (1-3 мМ).

Цель изобретения — повышение чувствительности и уменьшение расхода субстрата.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу гетероген- . ного иммуноферментного анализа антигена, включающему получение конъюгата специфического антитела и фермента, присоединение конъюгата и, определение антигена из образца к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение

3 11 589 количества антигена в образце, в качестве фермента используют неорганическую пирофосфатазу, а в качестве субстрата — соль пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-0,5 мМ.

Сущность изобретения заключается в использовании неорганической пирофосфатазы вместо щелочной и соли пирофосфорной кислоты вместо и-нитрофенилфосфата, Продуктом ферментатив- 10 ной реакции в предлагаемом способе является ортофосфат, для определения которого используется цветная реакция, изменение коэффициента зкстинкции для которой составляет око- 15 ло 70000 м см, что в 4,6 раза выше, чем для и-нитрофенола. Кроме того, измеряемая окраска изменяется от бледно-желтой в отсутствие определяемого антигена до ярко-синей в его 20 присутствии, что наиболее благоприятно для визуальной оценки результатов анализа, В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определения, особенно при ка-: чественном анализе наличия низких концентраций определяемого антигена.

Соль пирофосфорной кислоты, используемая в качестве субстрата, устойчива неограниченное время в твердом 0 состоянии, до 1 года в растворе при

4 С и до 2 месяцев в растворе при комнатной температуре. Константа

Михаэлиса для неорганической пирофосфатазы по пирофосфату составляет около 5 мкм, по причине чего можно использовать концентрацию субстрата 50 мкм, что в 200 раэ меньше, чем для щелочной фосфатазы.

Преимуществом изобретения являет- 40 ся также высокая стабильность фермента, который не изменяет активность в течение трех лет при комнатной температуре, и значительно меньшая стоимость субстрата, 45

Н р и м е р 1. Определение антигена вируса крапчатности гвоздики.

33 4 в буфере, содержащем 0,025 М оксиэ тилпиперазинэтансульфокислота — Na (pH 7,5) и 0,1 M NaC1 прибавляли

0,05 мл l -ного раствора глутарового альдегида в воде и инкубировали смесь о

1 ч при 20 С. Избыток глутарового альдегида удаляли гель-фильтрацией через колонку 1,5»10 см с Сефадексом С 50, уравновешенным 0,1 М буфером трис-НС! (рН 7,2) при 4 С. Доля крнъюгата в полученном препарате, по данным электрофореза в полиакриламидном геле, составляла около 40, остаточная активность неорганической пирофосфатазы — 42 . .!

Построение калибровочной зависимости. В углубления микроплата для иммуноферментного анализа последовательно вносили по 0,2 мл раствора антител к вирусу крапчатости гвоздики (2 мкг/мп) в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) с 0,15 И NaC1 с инкубацией в течение 18 ч при 4 С, по

0,2 мп суспензии очищенного вируса (1 мкг/мп) в 0,01 трис-HCI (рН 7,4), содержанием 0,15 М NaC1 и 0,1Х твин-20, с инкубацией в течение 1 ч при 37 С, и по 0,2 мл раствора конъюгата (0,15 ед/мл) в том же .буфере с Инкубацией в течение 2 ч о при 20 С. После инкубации мнкроппата с каждым из перечисленных компонентов микроплат промывали 3 раза

О, 01 М буфером тряс-HC I (рН 7,4), содержащем. 0,15 NaC1 и О, IX твин-20, Затем в лунки вносили 0,2 мп раствора Na

0,05 мп окрашивающего реагента .следующего состава, мас. : молибдат аммония 1,3; краситель малахитовый зеленый 0,07; твин-20 0,15; серная кислота 20; остальное вода. Через

10 мин измеряли оптическую ппотность при 630 нм с помощью денсито метра.

Получение конъюгата антител и неорганической пирофосфатазы. К

1 мп раствора 0,5 мг неорганической пирофосфатаэы с удельной активностью

600 ед/мг, выделенной из Е,coli, и

0,5 мг антител к вирусу крапчатости выделенных из сыворотки иммунизированного кролика и очищенных осаждением полиэтиленгликолем — 6000 и дказолом, Дпя получения сравнительных данных параллельно производили определение вируса в этих же препаратах известным методом..

: В табл.1 приведены данные для ряда известнйх концентраций антигена.

1158933

Таблица 1

Оптическая плотность

Концентрация антигена, нг/мл

1 редлагаемый способ при укаэанных концентрациях субстрата, мМ

Известный способ

0,05 0,5

0,02

0,069

0,160

0,251

0,416

0,761

О, 052

1,121 . 0,193

0,201

О, 308

0 401

О, 076 .0,079

0,)00

0,145

0,582

0,317

0,261!

О, 429

0,989

0,583

О, 881

1,48

1 20

В табл.2 представлены полученные

25 данные, Таблица 2

Образец

Предлагаемый способ

Известный способ

1 1,14 1 7

2 18 5 . 17 8

Как видно из таблицы, два способа дают близкие значения, Предлагаемым

40 способом наличие вируса в обоих образцах видно визуально, тогда как известным способом этого сделать нельзя и обязательно использование денситометра, Пример 2. Определение 13

S-глобулина семян гречихи.

Способ осуществляли согласно примеру 1, используя антитела к 13 S«« глобулину семян гречихи и концентра50 цию Na

Концентрация Оптическая

13 S-глобулина плотность семян гречихи, мкг/л

0,075

Как видно из таблицы, оптическая плотность, измеренная предлагаемым способом, выше чем измеренная известным способом, Видно также, что оптическая плотность в присутствии антигена возрастала с увеличением концентрации субстрата. Однако при этом возрастала также величина оптической плотности в отсутствие антигена (фон), При концентрации соли пиро. фосфорной кислоты 0,02 и 0,05 мИ оптическая плотность быпа стабильная в течение 1 ч, а при концентрации

0,5 мИ вЂ” возрастала íà 0 1 - 0,2 единицы, Таким образом, оптимальная концентрация соли пирофосфорной кислоты составляет около 0,05 мИ.

При визуальном анализе было обнаружено, что окраска проб изменяется от бледно-желтой в отсутствие антигена до ярко-синей при высокой концентрации антигена. Окраска в пробах с оптической плотностью выше 0,15 достоверно отличалась от окраски фона. В известном способе окраска изменяется от бесцветной в отсутствие антигена до желтой в присутствии антигена и окраска проб. достоверно отличается от окраски фона лишь при оптической плотности выше 1 единицые

Определение вируса крапчатности гвоздики в листьях гвоздики. Предлагаемым способом известно содержание вируса s экстрактах двух образцов листьев.

Содержание вируса, нг/мп

2,2

6,7

Корректор А. Тяско

: Редактор Н,Сильнягина

Техред А.Кравчук

Заказ 5905

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 и

Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная,4

7 1158933 8

0,137 ментного анализа и уменьшению рас- ходов на субстрат благодаря использо0,218 ванию более дешевого и стабильного при хранении субстрата и уменьшения

20 0,576 его потребляемого количества, Изобретение создает возможность для ши60 1,225 рокого внедрения иммуноферментного

Технико-экономическая эффектив- анализа и уменьшает потревность ность изобретения заключается в уве- в дорогостоящем денситомет— личении чувствительности.иммунофер-. fO pe