Способ осаждения нуклеиновых кислот из растворов,содержащих фосфатный буфер
1. СПОСОБ ОСАВДЕНИЯ НУКЛЕ (Л ИНОВЫХ КИрЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАс ЩИХ ФОСФАТНЫЙ БУФЕР с концентрацией солей 0,3 М, путем обработки раствора этиловым или изопропиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности и упрощения процесса, раста вор перед обработкой спиртом титруют 16 М формиатным буфером, имеющим ел рН 2,9-3,0, до значения рН раствора ,3,5-3,6. 2. Способ по п. 1,отличающий с я тем, что для осаждения дезсксирибонуклеиновой кислоты обрабатывают раствор одним объемом спирта , а для осаждения рибонуклеиновой кислоты - двумя объемами спирта. j
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
4(м) С 07 Н 21/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТБУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
110 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3614513/23-04 (22) 01.07.83 (46) 15.06.85. Бюл. У 22 (72) А.А. Ахрем, Д.Ю. Ландо и Т.А. йумилина (71) Институт биоорганической химии
АН БССР (53) 547.455.07(088.8) (56) 1. Кау Е.R.Ì., Simmons N.S., Donee А.L. An Improved Preparation
of Sodium Dezoxyribonucleate. — "J.
Am. Chem. Soc.", 1952, 74, 1724.
2. Markov С.С., Ivanov I.Ñ.
Hydroxyapatite Column Chromatography
in procedures for Isolation of
Purified DNA. — "Analytical Biochemistry" 1974, 59, 554 (прототип).
3. Сулимова Г.Е., Дрожденюк А.П., Ванюшин Б.Ф. Выделение и очистка ДНК из высших растений с помощью бромистого цетилтриметиламмония в сочетании с хроматографией на оксиапатите.—
"Биоорганическая химия", 1976, т. 2, 0 9, с. 1182 1188.
4. Ландо Д.Ю., Кульба А.M., Ахрем А.А. Влияние лигандов с избирательным характером взаимодействия на переход спираль — клубок ДНК !Ч.
Тепловая денатурация ДНК в кислой среде. — "Молекулярная биология", 1981, т. 15, В 5, с. 1093 1101.
5. Olins D.Å., Olins А.L., Hippel М.P. 0n the structure and
stability of DNA- Photometri and
„„SU<„, 1161511 А
DNA-Polypept ide comp Iexes.
"J. Mol. Biolog.", 1968, ч. 33, Р 2,.
265.
6. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник по биохимии.
Киев, "Наукова думка", 1971, с. 77, 882-883.
7. Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред. акад. А.Н. Белозерского. M., "Мнр", 1970, с. 183191.
8. Черененко Е.И., Галкин А.П., Лебедев В.р. Кох И.П. Щадящий метод выделения ДНК из ядер клеток насекомых. — "Укр. биох. ж.", 1982, 54, с. 316-321. (54) (57) 1, СПОСОБ ОСАЖДЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИ1.ЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФОСФАТНЫЙ БУФЕР с концентрацией солей « 0,3 М, путем обработки раствора этиловым или изопропиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности и упрощения процесса, раст вор перед обработкой спиртам титруют
t6 М формиатным буфером, имеющим рН 2,9-3,0, до значения рН раствора 3 5-3,6.
2. Способ по п. 1 ° о т л и ч а юшийся тем, что для осаждения дезоксирибонуклеиновой кислоты обра-. батывают раствор одним .объемом спирта, а для осаждения рибонуклеиновой кислоты — двумя объемами спирта.
1161511
Изобретение относится к усовершенствованному способу выделения нуклеиновых кислот, а именно к споI собу осаждения спиртом дезоксирибонуклеиновой (ДНК).и рибонуклеиновой (PHK) кислот из растворов в присутствии фосфатного буфера, который представляет собой водный раствор солей NaH>PO и Na КН РО . 16 Спирты, такие как этанол и изопропанол,,широко используются для прямого осаждения биополимеров и их компонентов 1), в частности нуклеотидов, олигонуклеотидов и нуклеино- 1ф вых кислот, из их водных растворов. Это наиболее распространенный и простой метод, который применяют при промьппленном производстве нуклеиновых кислот 20 Однако если в растворе присутствуют соли фосфатного буфера,то вследствие их нерастворимости в 50-70Х-ном этаноле получение осадка нуклеиновой кислоты без примеси солей невозможно.25 Известен способ спиртового осаждения нуклеиновык кислот, который заключается в предварительном диализе раствора нуклеиновых кислот для удаления солей фосфатного буфера с по-, следующим осаждением этанолом 12) . Недостатками способа являются его длительность (1S-часовой диализ), а также то, что при диализе происходит частичная потеря биополимеров, свя3S занная с их сорбцией на диализной мембране. 2 зтанола, отделения образовавшегося осадка, представляющего собой смесь фосфата кальция и ДНК, центрифугированием, обработки его этилендиамином для растворения солей кальция и диализа растворенных солей. ДНК осаждают этанолом после добавления хлорида натрия до концентрации NaC1 в смеси 0,2 M. Для получения растворов ДНК, содержащих фосфатный буфер с концентрацией солей 0,24 М, исходный раствор обычно разбавляют водой. Выход полученной ДНК не указан (4) . Основными недостатками этого метода являются, длительность стадии диализа и трудоемкость стадий перерастворения и центрифугирования. Цель изобретения — сокращение длительности и упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу осаждения нуклеиновых кислот из растворов, содержащих фосфатный буфер с концентрацией солей 0,3 М, раствор перед обработкой этиловым или изопропиловым спиртом титруют 16М формиатным буфером, имеющим рН 2,9-3,0 до значения рН раствора 3,5-3,6. При этом для осаждения ДНК обрабатывают раствор одним объемом спирта, а для осаждения PHK — двумя объемами спирта. Обычно снижение концентрации солей натрий-фосфатного буфера осуществляют путем разбавления исходного о или охлаждения его до 0 С с послеИзвестен также способ осаждения нуклеиновых кислот из растворов в присутствии фосфатного буфера„ за- 40 ключающийся в добавлении бромистого центилтриметиламмония (цетавлона) ,в количестве 4 мг на 1 мг ДНК. Выход составляет 95Х Ц . Однако необходимость проводить в дальнейшем очист- 4S ку полученного продукта от цетавлона, включающую растворение осадка, центрифугирование и двухкратное переосаждение этанолом, приводит к уменьшению выхода продукта. 56 Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ осаждения нуклеиновых кислот, в частности ДНК, из растворов, содержащих фосфатный буфер с концентрациейсолей Я приблизительно 0,24 М, путем обработки 1 мл исходного раствора 0,1 мл 0,5 M раствора хлорнда кальция и 1мл дующим сливом надосадочной жидкости. Снижение концентрации солей калийфасфатного буфера достигается раэ; бавлением исходного раствора, поскольку гидроортофосфат и дигидроортофосфат калия обладают большей растворимостью, чем фосфорнокислые соли натрия, и при охлаждении не выпадают в осадок. При исходных значениях концентрации солей ниже 0,3 М первую стадию вообще опускают. Для осаждения ДНК обычно используют один объем спирта, а при осаждении PHK два объема, Известно, что при комнатной температуре 50Х-ная денатурация ДНК имеет место при рН 2,9 14 . Кроме того, согласно $5) наличие в растворе 50-70Х этанола понижает темперутуру плавления ДНК, что эквивалентно повышению кислотности денатурации 11 4 при спиртовом осаждении. Установлено, что при использовании формиатного буфера со значением рН 3, 1-3,2 возрастает необходимый для титрования объем этого буфера, а выход ДНК и PHK при последующем осаждении спиртом снижается. Буфер со значением рН 3,5 нельзя использовать, поскольку при этом не удается осадить нуклеиновые кислоты спиртом в присутствии фосфатного буфера. Выбор для осаждения формиатного буфера, а не глицин-HC1 mrH фталатНС1 буферов, у которых диапазон значений рН включает 2,9-3,0 93, обусловлен тем, что растворимость в воде глицина и фталевой кислоты значительно ниже, чем муравьиной кислоты. Максимальная концентрация глицин-НС1 буфера не превышает 3 М, концентрация фталат-НС1 буфера ниже. При подкислении раствора нуклеиновых кислот, содержащего фосфатный буфер необходимо добавлять большой объем подкисляющего агента, что ведет к разбавлению растворов ДНК и РНК, в результате чего снижается выход нуклеиновых кислот при спиртовом осаждении и возрастает расход этилового (или изопропилового) спирта. Для титрования растворов необходимо использовать наиболее концентрированный формиатный буфер, максимальная концентрация которого 16М. Уменьшение концентрации буфера нецелесообразно, так как при этом возрастает раэбавление титруамого раствора нуклеиновой кислоты и, как результат этого, снижается выход целевых продуктов, а расход используемого для осаждения спирта возрастает. Таким образом, существенным отличием предлагаейого способа является титрование растворов, содержащих фос-. фатный буфер, перед обработкой спир том 16 И формиатным буфером, имею- щим рН 2,9-3,0, до значения рН раствора 3 5-3,6. Качество получаемых согласно предлагаемому способу препаратов ДНК и PHK проверяли хроматографическими и спектроскопическими методами. Для титрования используют формиатный буфер, имеющий рН 2,9-3,0. Нижняя граница рН буфера 2,9 подобрана с таким расчетом, чтобы при подкисленны, которое осуществляется путем добавления формиатного буфера к раствору нуклеиновой кислоты при одновременном перемешивании с.помощью магнитной мешалки, не произошла денатурация биополимера. При значении рН, которое имеет используемый для титрования буфер, денатурацня дезоксирибонуклеиновой кислоты, например, протекает за десятки секунд. Но поскольку перемешивание раствора и выравнивание рН происходит sa период времени, который меньше на целый порядок, то биополимер после такой обработки остается в нативном .состоянии, Однако значение рН можно снизить. Так, согласно Ятитрование раствора ДНК проводят с помощью концентриро- 35 ванной соляной кислоты (т.е. рН тит. рующего агента ниже 2,9). Титрование растворами, рН которых ниже критического значения 2,9, при котором начинается денатурация ДНК, 40 осложняет проведение процесса. Для предотвращения длительного локального понижения рН титрующий агент добавляют в микроколичествах (каннлляром) при крайне интенсивном перемешивании 45 на магнитной мешалке. Это увеличивает трудоемкость метода и делает его неприемлемым для работы с, большими объемами нуклеиновых кислот, так как объем добавляемого титрующего агента 50 и скорость перемешивания становятся критическими моментами. Верхний предел значений рН формиатного буфера выбран с таким расчетом, чтобы максимально снизить раз-55 бавление раствора нуклеиновой кислоты при титрованни, а следовательно, уменьшить потери целевых продуктов На фиг. 1 представлены результаты анализа хроматографической очистки на гидроксиапатите исходного препарата ДНК печени крысы в присутствии примесей РНК; на фиг.2 — то же, з 11615 :на 0,125-0,35 ед., т.е. до значения рН 3, 15-3,25. Поэтому титрование растворов ДНК или PHK содержащих фосфатный буфер, заканчивают, когда рН раствора достигает 3,5-3,6, что выше значения денатурации. Значение рН более высокие, чем 3,6, использовать нецелесообразно, так как это приводит к снижению растворимости солей фосфатного буфера в водно- 10 спиртовой смеси и затрудняет процесс осаждения. 11615 исходного препарата дрожжевой РНК; на фиг.3 - то же, ДНК печени крысы после спиртового осаждения из фосфатного буфера с предварительным подкислением; на фиг.4 — то же, дрож- 5 женой PHK после спиртового осаждения из фосфатного буфера с предварительным подкислением; на фиг.5 — кривая плавления ДНК печени крысы после спиртового осаждения иэ фосфатного буфера с предварительным подкислением. Препараты ДНК и PHK получаемые согласно предлагаемому способу проверяли на нативность и степень чис- 1З тоты. Нативность указанных биополимеров устанавливали по концентрации элюции с гидроксиапатита, а также по гиперхромному эффекту и темпераTvpe плавления. 20 Известно, что при элюции с гидроксиапатита линейным градиентом концентрации Na-фосфатного буфера (NaФБ) нативная ДНК элюируется при концентрации последнего, превышающей, 25 0,2 M в то время как PHK и денатурированная ДНК элюируются при более низкой концентрации Na-ФБ (0,130,15 М). Следует отметить, что,при наличии смеси нативной и денатуриро- gp ванной ДНК соответствующие им пики полностью разделяются. Показано, что концентрация элюции ДНК составляет 0,23 И, à PHK — О, 140,15 М Na-ФБ; рН 6,86 (фиг. 1 и 2). После спиртового осаждения ДНК и PHK иэ фосфатного буфера .с предварительным подкислением 16 И формиатным буфером полученные осадки биополимеров растворяли и проводили их повторную хроматографию, Как видно из фиг. 3 и 4, концентрация элюции как ДНК, .так и PHK не изменяется после осаждения предложенным способом. ДНК и PHK элюируются одиночными пиками соответственно в области 0,23 И и 0,14 М Иа-ФБ, что говорит о нативности и гомогенности этих препаратов. Спектрофотометрическое определение гиперхромизма получаемых согласно 4 предложенному способу образцов ДНК при нагревании последних до 100 С с последующим добавлением формальдегида и охлаждением дало значение гиперхромного эффекта от 39,4 до 40,5> что характерно для нативных ДНК, Такое же:значение гиперхромного эффекта получено при плавлении препаратов 11 б ДНК, полученных после спиртового осаждения из фосфатного буфера с предварительным подкислением, на спектрофотометре СФ-4..Температура плавления Т составила 86,6 С, что также характерно только для нативных ДНК (7) . Кривая плавления ДНК печени крысы, в растворе, содержащем 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата Na (рН 7,3), изображена на фиг.5. Чистота препаратов ДНК и PHK определялась их спектральными характеристиками. Препарат нуклеиновой кислоты считается чистым, если для его спектра выполняются соотношения Еасоф /Ело 1,8; Е ао/Ело 2 (Е > — оптическая плотность при длине волны, равной 1 81 . В таблице приведены спектральные характеристики препаратов ДНК печени крысы и дрожжевой PHK до и после осаждения. Как видно иэ таблицы, обработка формиатным буфером перед осаждением не загрязняет препаратов нуклеиновых кислот. Наоборот, спектральные характеристики ДНК и PHK после спиртового осаждения нз фосфатного буфера с предварительным подкислением по сравнению со спектральными характеристиками исходных препаратов несколько улучшаются. Пример 1. Осаждение ДНК из растворов, содержащих 0,5 М фосфатный буфер (рН 6,9). 15 мл раствора ДНК печени крысы (О, 18 мг/мл; 3,6 о.с.) мл; 2,7-10 г),,содержащего Na-фосфатный буфер в концентрации 0,5 М охлаждают в химическом стакане до 0 С и выдерживают при о этой температуре в течение 10 мин. При этом выпадают кристаллы солей фосфорной:кислоты, после чего надосадочную жидкость осторожно сливают в чистыйхимический.стакан.Концентра- ция буферапри этомснижается до0,3 М. Слитый раствор титруют 16 М формиатным буфером рН 3,0 при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Перемешивание прекращают, когда рН титруемого раствора достигает значения 3 5. После окончания титрования к раствору ДНК добавляют 17,5 мл этанола. Выйадает осадок ДНК, его собирают. Получают 2,45 ° 10 r (94 ) ДНК. Пример 2. Осаждение ДНК из раствсров, содержащих 0,25 М Ма-фосфатный буфер (рН 7,0). 11615 Спектральные характеристики Препарат аво Иапо Е Ивъо ДНК печени крысы до осаждения 1,84 2,2 ДНК печени крысы после осаждения предлагаемым способом 2,3 1,85 PHK дрожжей до осаждения 1,9 2,17 PHK дрожжей после осаждения Предлагаемым способом 2,2 14,8 мл раствора печени крысы (0,045 мг/мл; 0,9 о.с./мл; 0,67. 10 г), содержащего 0,25 М Na-фосфатный буфер, титруют в химическом стакане формиатным буфером (16 М, рН 2,9), перемешивая раствор при помощи магнитной мешалки, до значения рН 3,5..Затем к раствору добавляют 16 мл изопропанола, собирают выпавший осадок. Получают 0,54 ° 10- г 10 (80K) ДНК. Пример 3. Осаждение PHK из растворов, содержащих О, 15 M Na-фосфатный буфер (рН 7,0). Суммарный пул фракций, содержащих 15 PHK дрожжей и собранных после хроматографии на оксиапатите, представляет собой раствор PHK (10,0115 мг/мл; 2,3 о.с./мл; 1,495<10 г) в 0,15 М Na-фосфатном буфере, рН 7,0. 13 мл 2б этого раствора подкисляют 16 М формиатным буфером на рН-метре до значения рН 3,5 при перемешивании на магнитной мешалке. Затем приливают к раствору PHK 27 мл этанола и выдер-д живают при -20 С в течение 1 ч. Выпавший осадок PHK собирают центри11 8 фугированием (18 тыс. об./мин) в течение 10 мин. Выход PHK составляет 1,230 10 з r (82,5X). Пример 4. Осаждение ДНК из растворов, содержащих 0,5 M К-фосфатный буфер (рН 7,2). 15 мл раствора ДНК печени свиньи (10, 10 мг/мл; 2 о.с./млр 1,5 ° 10 г), содержащего 0,5 М К-фосфатный буфер (рН 7,2), предварительно разбавляют дистиллированной водой в 2 раза. После подкисления формиатным буфером на рН-метре до рН 3,56 с одновременным перемешиванием раствора магнитной мешалкой добавляют 32,4мл этанола. Осадок отделяют, выход ДНК 1 27. 10-з г (84,5Х) Таким образом, предлагаемый способ осаждения нуклеиновых кислот позволяет быстро и с высоким выходом выделять ДНК или PHK из растворов, содержащих фосфатный буфер, осуществляется при любом объеме раствора и не требует длительного и трудоемкого диализа. 116t511 Я 9 К Яф Щ вшэонбвиор МЪ 4ф Ф Ъ %1 ъ, Ф % М Ф М ф М, ф файф с8 сЯ @ 4 %ем фф е3 Ы ниро ndu юшзоншоии взмланлаюд 11615i1 Я ВК4 Цф ОЯ ФШЖИВВиоур 4 53 и В М Э Ot 1161511 О, «Ю «С5 М Z0 b щ f0 сз фЯ ф ф :Ф Фиг.4 ф Ф 1 . Ф Ю7 дб О 04 D,3 0,2 0,20 o,fa ф w 0l6 % а 014 300 e 010 9DS ь à06 Ъ 004 002 If 17 )Я Номер фракции 26 30 И Я Номер фрцщци «Ю « ь u4 0Р Ю1 ф % 1, 1161511 Составитель И. Корсакова Редактор Т. Колб Техред М,Гергель Корректор И. Эрдейи Закав 3935/29 Тираж 354 Подписное В ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 ° Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
