Способ определения активности тромбина

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА путем взаимодействия с фибриногеном и последующим определением его активности по уровню фибринопепгидов А и В в опытной и контрольной пробах , отличающийс я тем, что, с целью повьшения специфичности определения, в исследуемую пробу дополнительно вводят фибриноген, обработанный 5-диметиламиносульфанилхлоридом в конечной концентрации 2-5 мг/мл далее определяют интенсивность флюоресценции в исследуемом растворе после отделения , фибрина, а активность тромбина ( ) определяют по формуле где Од и 3 интенсивность флюоресценции опытной и контрольной пробы;, степень усиления флюМ ориметра; К коэффициент , равный отношению величины ел интенсивности флюоресценции к активности тромбина в стандартной пробе.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1 1 78 А

4(g)) G 01- N 33/48, А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ концентрации 2-5 мг/мл далее определяют интенсивность флюоресценции в исследуемом растворе после отделения . фибрина, а активность тромбина (С ) определяют по формуле с,=к! „), о и 1»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3474519/28-13 (22) 21 ° 07.82 (46) 15.06.85. Бюл. N - 22 (72) В.А.Сятковский и Е.В.Барковский (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (53) 612. 115(088.8) (56) Biochem. I. 1963, 89, р. 378 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРОИБИНА путем взаимодействия с фибриногеном и последующим определением его активности по уровню фибринопепгидов А и В в опытной и контролвной пробах, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения специфичности определения, в исследуемую пробу дополнительно вводят фибриноген, обработанный 5-диметиламиносульфанилхлоридом в конечной интенсивность флюоресценции опытной и контрольной пробы;. степень усиления флюориметра; коэффициент, равный отношению величины интенсивности флюоресценции к активности тромбина в стандартной пробе.

1161878

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике нарушениИ системы свертывания крови.

Цель изобретения — повышение специфичности анализа активности тромбина.

Сущность изобретения заключается в следующем.

В качестве субстрата для определе-1О, ния активности тромбина применяется раствор дансилированного фибриногена. Дансилирование. фибриногенаосуществляется по методу, сущность которого заключается в том, что 15 аминогруппы фибриногена реагируют с флюоресцентным красителем дансилхлоридом в щелочной среде с образованием ковалентной связи. Под влиянием тромбина от молекул дансилированпого 2О фибриногена отщепляются флюоресцентно-меченные ниэкомолекулярные фибринопептиды А и В.

После осаждения белков из реакционной смеси 30%-ной трихлоруксусной кислотой количество фибринопептидов в надосадке определяется флюориметрически. При определении количества тромбина в биологических жидкостях на результаты определения не отража- ЗО ется наличие в н@х других нивкомолекулярных пептидов ввиду отсутствия флюоресцентной метки у последних.

Примеры конкретного применения способа.

П у и м е р 1. Определение активности, тромбина в модельной системе.

По 2 мл 1%-кого раствора дансилированного фибриногена разливали в

4 пробирки. В каждую пробирку добавляли по 0,1 мл раствора тромбина в следующих соотношениях: 1:1; 1.:2;

1:4; 1:8. Через 15 мин реакцию прерывали добавлением 2, О мл 30%-ной ТХУ кис-49 лоты. Пробы центрифугировали 10 мин при

1300 а . Надосадочную жидкость флюориметрировали на микрофлюориметре

Pica-55. Длина волны возбуждения флюоресценции 365 нм; длина волны ge регистрации флюоресценции 520 нм.

В контроле к 2,0 мл фибриногенар добавляли 0,1 мл 0,9%-ного раствора

NaC1. Данные приведены в табл, 1.

Результаты выражены в единицах отно- у сительной активности.

Активность тромбина рассчитывают по формуле где ) и 3 — интенсивность флюоресценции опытной и контрольной проб;

h — степень усиления прибора", — коэффициент пропорциональности, рассчитываемый экспериментально для конкретного типа флюориметра путем деления интенсивности флюоресценции опытной пробы на количество единиц активности тромбина в пробе.

Hp и м е р 2. В 4-х пробах к

0,5 мл исследуемой цитратной плазмы добавляли 1,5 мл раствора дансилированного фибриногена, содержащего 105=2-1 мг белка. Для рекальцификации вносили 0,1 мл 1,28Х-ного раствора хлористого кальция. Через 15 мин реакцию прерывали добавлением 2,0 мл

30%-ного раствора ТХУ кислоты. В конт= роле вместо раствора хлористого кальция добавляли О, 1 мл 0 9Х-ного раствора NaC1. Пробы центрифугировали

10 мин при 1300ф, Надосадочную жидкость флюориметрировали на микрофлюориметре Pica-55, длййа волны возбуждения 365 нм, длина волны регистрации флюоресценции 520 нм.Результаты выражали в единицах относи-:тельной флюоресценции (табл. 2).

Сравнение этих данных с результатами примера 1 показывает, что активность тромбина в пробах плазмы была низкой, соответствуя большим разведениям тромбина (1:8 — 1:16), вызывая однако достаточную рабочую интенсивность флюоресценции фибричопептидов при установке чувствительности прибора на среднюю степень, I

Пример 3. С целью сравнения чувствительности определения белка и его дериватов методами Лоури и предлагаемым способом (флюориметрически) проведены следующие исследования. Приготовлены разведения дансилированного фибриногена, содержащие в пробе от 2800 до 0,14 мкг белка.

Производили определение белка в пробах по методу Лоури и флюориметрически на микрофлюориметре Pica-55 при длине волны возбуждения флюоресценции 365 нм и длине волны ре1 l F 18":3 гистрации 520 нм. Полученные данные представлены в табл. 3.

Пример 4. Тромбин-Фибрияогеновая реакция поставлена в следующей системе. К 2,0 мл 0,5Х-ного 5 раствора дансилированяогс фибриногена добавлено 2,0 мл 40Х-ного рас-,— вора мочевины и 0,2 мл раствора тромбина с активностью 10 с. Пробу инкубировали при 37 С 90 мин. После инкубации в пробу для осаждения фибриномономеров и трсмбина добавляли 2,0 мл 8Х-ного раствора хлорной кислоты. Пробу центрифугировали

15 мин. при 8000 обм/мия. Надссадочную 15 жидкость, содержащую Фибрияспептиды

A и В, отсасывали и ксррекгировали ее до 7.,5 с добавлением 0, 12 мл

10Х-ного раствора КОН.. Соленой осадок удаляли повторным центрифугиро- 39 ваняем в том же режиме. Готовили разведения Фибринопептидон А и В на физиологическом растворе в 3, 12 и

120 раэ, анализ проб осуществляли методом Лоури, как в прототипе, и йЯ флюориметрически, как в предлагаемом способе.

Выход фибринопептидов А и Б составил порядка. 1:60 от веса взятого

Фибринсгена, что совпадает с иэвест- у ными данными теоретического анализа.

Таким образом, полученные данные показали, что для успешного применения метода Лоури для клинического определения Фибринопептидов А и В как специфических показателей активности тромбина в тромбин-фибриногенной реакции их содержание в пробе должно быть выше 10 мкг (табл. 2, 3), что совпадает с известными данными литературы.

Флюориметрический анализ позволяет увеличить чувствительность способа . на 10

Столь значительноеповышение чувст вительности способа и приведенные данные показывают, что содержание дансилироваяного Фибрияогена в пробе в зависимости от активности тромбина может колебаться в значительных .$6 пределах (6-6х10 мкг). Однако оптимальные колебаяия содержания дансилирсваннсгс фибриногена в пробе, ориентированные с одной стороны на низкие значения тромбиновой активности, а с другой - на рациональное расходование реагента (как показывают примеры 1 и 2) составляют 2-5 мг. При этом создается возможность анализа активности тромбина по уровню отщепляемых им от фибриногена фибринопептицов А и В не только в модельных системах (как в прототипе), но и в биологических образцах (плазма, сыворотка).

Пример 5. С целью выявления специфичности метки А и В пептидов

Фибриногеяа различными флюоресцентс ными зондами в технике предлагаемого способа были применены препараты

Фибриногена, меченного аналинонафталиясульфонатсм магния (АНС), флюорескамином (ФК) и диметиламинонафталинсульфонилхлоридом (ДНС), являющиеся одним иэ относительно широко применяемых Флюоресцентных зондов.

Б параллельных исследованиях в модели применялись растворы троибина (г.Каунас) с пропорционально снижающейся активностью (40, 20 и

10 ед.). Данные флюоресцентного свечения Фибринопептидов А и В в аналогичных системах опытов (фпюориметр "Хиттачи", Япония) представлены в табл. 4.

П р и q е р 6. К 0,5 мл исследуемок цифтратнсй плазмы добавляли

1,5 мл 1Х-ного раствора дансилированного Фибриногена. Для рекальциФикацяи внесено О, 1 мл 1,28Х-ного раствора хлористого кальция. Через

15 мин реакцию прерывали добавлением

2,0 мл ЗОХ-ного раствора ТКУ кислоты, Б контроле вместо раствору хлористого кальция добавляли О, 1 мл 0,9Х-кого раствора NaC1. Пробы центрифугировали

1G мин при 1300$. Надосадочную жидкость флюориметрировали на флюорнметре Раса-55, длина волны возбуждения 365 нм, длина волны регистрация

520 нм.

Результаты выражены в единицах относительной Флюсресценцни: коятроль—

3 ед, проба - 18 ед.

1161878

Т а б л и ц а

Зависимость флюоресценции фибринопептидов от количества дансилированного фибриногена в пробе ю

Интенсивность флюоресценции

2,2

15

Таблица 2

Всего фибриногена в пробе, мг

У

2,5

3,5

6,5

11,5

Количество дансилилированного фибриногена в пробе, мг

Т аблица 3

Сравнительные данные чувствительности метода Лоури и флюоресцентного анализа при определении белка

14 1,4 0,14

1400 140

2800

Содержание белка, мкг

20 200 2000 20000

Степень разведения

Больше Больше 0,48 0,07 0 шкалы шкалы

ФЭК ФЭК

Энстанкция по Лоури

26323214

200

120

Флюоресценция, усл.ед.

Разведения тромбина

1: 1

20 ед

1: 2

10 ед.

1: 4

5 ед

1: 8

2,5 ед

Контроль

2,0 ед

1161878

Таблица 4

Результаты определения активности тромбина по технике предлагаемого способа с применением фибриногена, меченного различными флюоресцентными зондами (усл,ед).

Активность растворов тромбина (ед.) Зонд

10 0 (Контроль

АНС

1,4

1,2

1,4

4,1

4,1

ФК

4,7

9,0

ДНС

Составитель .В. Кузьмичев

Редактор M. Келемеш Техред Т.Маточка Kîððåê С, щ оррек тор,С. Шекмар

Заказ 3965/47

Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r; Ужгород, ул, Проектная, 4

4,7

16,2

)