Способ определения фотосенсибилизирующего действия химических веществ на биологические объекты
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ SHE r i;i;i ВЕЩЕСТВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ путем сравнительного исследования освещенной и неосвещенной систем, содержащих биологический материал и фотосенсибилизатор, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени и повышения чувствительности способа, систему,содержащую мембраны саркоплазматического ретикулума мьшц и тестируемое соединение, освещают, затем рН-метрически определяют количество молей транспортироo«t ванного в мембраны Са в расчете на моль АТФ, причем снижение этого показателя в освещенном образце свидетельствует о фотосенсибилизирующем действии тестируемого химического ве (Л щества. 00 CD
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
„„SU,,11 1
Ф ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3601141/28-13 (22) 06. 06. 83 (46) 15.06.85,Бюл. У 22 (72) Ю.П.Козлов, В.Е.Каган, А.М.Бейм, В.Б.Ритов, В.M.Ñàâîâ и Л.И.Степанова (7 1) МГУ им. М.В .Ломоносова и Инсти тут экологической токсикологии (53) 612.014.46(088.8) (56) 1. Иванов И.И. и др. Образование первичного продукта взаимодействия токоферола с синглетным кислородом в мембранных системах. Доклады АН СССР, т.245, У 4, 1979, с.9981000. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУКЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ . ВЕЩЕСТВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ путем сравнительного исследования освещенной и неосвещенной систем, содержащих биологический материал и фотосенсибилизатор, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью сокращения времени и повышения чувствительности способа,. систему, содержащую мембраны саркоплазматического ретикулума мьппц .и тестируемое соединение, освещают, затем рН-метрически определяют количество молей транспортиро2+ ванного в мембраны Са в расчете на моль АТФ, причем снижение этого показателя в освещенном образце свидетельствует о фотосенсибилизирующем действии тестируемого химического вещества.. 1161879 Изобретение относится к фармакологии, медицине и может быть использовано для оценки фотосенсибилизирующего действия различных агентов на биологические объекты. 5 Целью изобретения является сокращение времени и повышение чувствительности способа. Пример. Для получения фрагментов саркоплазматического ретикулу.10 ма белые скелетные мышцы кролика или спинные мышцы рыбы (200 r) промывают в охлажденном 0,97.-ном растворе NaC1 измельчают ножницами и помещают в среду, содержащую 0,3 М сахарозы,,15 0,1 мМ ЭДТА, 1,5 мм АДФ и 10 мМ гистидина, рН 7,7, объем среды . 300 мл. Гомогенизирование проводито ся при 4 С ножевым гомогенизатором до полного измельчения ткани (удо- 20 бен гомогенизатор типа "Политрон") . Гомогенат центрифугируют при 11 000 g 20 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через несколько слоев марли и центрифугируют при 25 40 000 g 60 мин. Осадок суспендируют в 400 мл среды, содержащей 0,6 M КС1, О, 1 мМ ЭДТА, 0,2 мм СаС1, сывороточный альбумин человека (0,6 мг/мл), 5 мМ гистидина, рН 7,4, и после 1 ч инкубации при слабом перемешивании центрифугируют 20 мин при 11 000 g. Осадок отбрасывают, а супернатант центрифугируют при 45 000 g 60 мин. Осадок, представляющий собой фрагменты саркоплазматического ретикулума, суспендируют в 12 мл среды, содержащей 25Х глицерина (по объему) 0,2 мМ СаС1, 0,1 мМ.ЭДТА, 10 мМ гистидина, рН 7,2 при 4 С. Полученный препарат 40 о может храниться при -20 С в течение. месяца и годен для проведения более 1000 измерений . Регистрацию параметров транспорта +ф Са ферментативной системой мембран 45 саркоплазматического ретикулума проводят методом рН-метрии с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-41 Г-04. : В качестве электрода сравнения используется хлор-серебряный электрод, 50 соединенный агаровым мос"гиком с измерительной ячейкой. Регистрация изменения рН, происходящая в результате гидролиза АТФ ферментативной системоймембран санкоплазматического 55 ретикулума, проводится при помощи рН-метра ЛПУ-0,1, а запись — на согласованном с ним электронном потенциометре КСП-4. Измерение производит ся в ячейке из оптического стекла прямоугольной формы размером 23 12» <30 мм. Длина оптического пути ячейки составляет 10 мм. Ячейка помещается в термостатируемый держатель, изготовленный таким образом, чтобы одна его сторона была открыта для освещения. Освещение ячейки проводят 250-ваттной кварцево-галоидной лампой, освещенность 100 000 лк/см длительность освещения 10 мин ° Инкубационная смесь в ячейке содержала, мМ: NaC1 100; MgC1< 4, оксалат натрия 5, АТФ 2, имидазол 2.5, рН 7,0. В ячейку вносят 25 кг белка фрагментов саркоплазматического ретикулума. Измерения проводят до внесения испытуемого вещества, после внесения испытуемого вещества в известной концентрации и после освещения ячейки, содержащей систему транспорта Са и испытуемое вещество. В ячейку вносят 100 мМ СаС1, это приводит к резкому закислению.среды инкубации (кривая 1) Через некоторое время скорость закисления снижается и на кривой появляется "перегиб", свидетельствующий о том, что весь имеющийся в инкубаФ+ ционной среде Са закачался внутрь пузырьков саркоплазматическога ретикулума. Опыт повторяется в присутствии в системе фотосенсибилизатора красителя — основной фиолетовый К в концентрации 12,5 мг/л. Измерение повторяется третий раз после освещения системы в течение 10 мин. Приняв темновой образец эа 1007., производят расчет фотосенсибилизирующего действия красителя на транспорт ионов Са + . Вычисляют отношение Са /АТФ. Величина добавления Са (в моль) делится на величину образовавшегося неорганического фосфата (в моль), который определяется из калибровки, относительно добавки 10 мМ КН РО,1.. Результаты выражают в процентах относительно контрольного (уровня) измерения (в присутствии красителя). Результаты анализа некоторых красителей приведены в табл. 1. Фотосенсибилиэированное повреждение системы транспорта ионов Са++ красителями целлюлозно-бумажного производства в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мьппц кролика (в 0 к контролю).! 161879 Продолжение табл.2 Сокращение времени и повышение чувствительности в сравнении с прототипом приведено в табл. 2. Таблица 1 Предлагаемый способ Прототип б) Приготовление липосом — не менее 1 ч Са /АТФ Концентрация сенсибилизатора, мкг7л б) Процедура отсутствует Свет Темнота в) Время измерения (необходимо снять не мепее 13 5 точек для получения кинетической кривой) 1-2 ч в) Время измеренияне более 1О мин 100 100 Контроль 0 Прямой чисто-голубой 25 Основной фиолетовый "К" 25 44 Прямой красный "2 с" 25 Нигрозин 25 Приготовление липосом необхо0 97 100 димо перед каждым экспериментом. Таким образом, суммарное время измерения по способу-прототипу — не ме99 нее 2 ч Хризеидин 25 Основной ярко-зеленый 25 93 Основной синий "К" 25 Чувствительность способа Достижение 50Х фотосенсибилизированного действия регистрируется при одинаковом освещении следующими концентрациями красителя (МКГ/Л): Прямой часто-голубой 130210 12,5+0,3 Прямой красный "2 с" 167113 14,010,5 Зсновной ярко-зеленый 240+25 50,(90,7 Предлагаемый способ Э5 Прототип Составитель Н.Гуляева Редактор М.Бандура Техред Т.Маточка Корректор С.Шекмар. Заказ 3965/47 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðoä, ул.Проектная, 4 П р и м е ч а н и е. Освещение 100 000 лк/см 10 мин. Таблица 2 Время осуществления a) Выделение ле- а) Выделение ретицитина для приго- кулума — не более товления липосом — 4 ч. не менее 8 ч Выделение мембран можно проводить раз в месяц (храо нение при -40 С не изменяет их функциональных свойств) Суммарное время измерения, таким образом, составляет не более 10 мин для одного образца и может быть автоматизировано
