Способ выращивания уксусно-кислых бактерий @ @

 

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS , предусматривающий приготовление инокулята клеток бактерий с последующим внесением его в питательную среду , содержащую сорбит в качестве источника углерода и дрожжевой автолизат в качестве стимулятора роста, отличающийся тем, что, с целью повьпиения скорости размножения бактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, внесение инокулята в питательную среду осуществляют совместно с панкреатической дезоксирибонуклеазой , взятой в концентрации Ы( 2-10 мг/мл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ()9) ()() 4(5() С 12 N 1/20, С 12 N I/20, С 12 R 1:01

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ

ТЕ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ = 4@ " (21) 3593054/28-13 (22) 20.05.83 (46)23.06.85. Бюл. 1(23 (72) Ф.Г.Куприянова, П.В.Вострецов, В.Г.Винтер, К.С.Павлова, Л.Ф.Петрова и N.Н.Ситникова (71) Казанский государственный ордена

Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени университет им.В.И.Ульянова-Ленина (53) 576.8(088.8) (56) Беляева М.И., Куприянова Ф.Г., Буриненко Б.М. Влияние панкреатической дезоксирибонуклеазы на размножение Escherichia coli, Микробиология.

1976i 45, вып.5. с.917-919.

Технологический регламент производства аскорбиновой кислоты ВПО

"Союзвитамины", Йошкар-Ола. Утвержден в управлении "Союзвитамины" Министерства медицинскс:: промышленности, 1981. (54) (57) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, предусматривающий приготовление инокулята клеток бактерий с последую щим внесением-его в питательную среду, содержащую сорбит в качестве источника углерода и дрожжевой автолизат в качестве стимулятора роста, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения скорости размножения бактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, внесение инокулята в питательную среду осуществляют совместно с панкреатической дезоксирибонуклеазой, взятой в концентрации

1:10 — 2 -10" мг/мл.

1162876 где 0,396

Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности к способам выращивания уксуснокислых бактерий, преимущественно используемых в производстве аскорбиновой кислоты, Цель изобретения — повышение скорости размножения бактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, Пример 1, Выращивание Gluco- ip

nobacter oxydans в лабораторных условиях в питательной среде, содержащей панкреатическую ДНКазу. При изучении влияния панкреатической ДНКазы на скорость размножения уксуснокислых 1 бактерий и на жизнедеятельность мик— роорганизмов, приявляющуюся в способности их окислить сорбент в сорбозу.

Gluconobacter oxydans культивируют в питательной среде следующего со- 2р става мл: сорбит 400 (23-287. -ный раствор ), дрожжевой"автолизат 60 (6Х. сухих веществ ), вода 540. Содержание сухих веществ в питательной среде должно быть не менее 10-127, 25 рН 5,0-5,6.

Для подготовки посевного материала двухсуточную культуру с поверхности агаризованной среды указанного состава переносят в пробирки с жид- gg кой средой того же состава, инкубируют в термостате при 32 С в течение

48 ч, после чего суспенэию разбавляют в 10 раэ свежей средой и разливают по 50 мл в колбы емкостью

500 мл. Одновременно в колбы вносят панкреатическую дезоксирибонуклиазу (ДНКазу !и культуру выращивают при

32 С 48 ч. Через 3,12,24,36,48 ч после посева отбирают прббы для ре- гистрации скорости размножения клеток, определяемой по приросту биомассы на спектрофотометре, при длине волны

640 нм. В этих же пробах контролируют глубину окисления сорбина в сорбо- . ! зу. С этой целью отбирают 50 мл испытуемого раствора в мерную колбу емкостью 100 мл, куда добавляют 1 мл

50Х-ного раствора азотнокислого свинца и 1 мл 5Х-ного раствора NaOH.

Содержимое колбы доводят до метки водой, энергично встряхивают и фильтруют. Затем с помощью поляриметра определяют угол вращения в прозрачном испытуемом растворе, Содержание сорбоэы в исследуемой пробе (г/л )определяют по формуле

Х = 0,396 (К-P ) 2, 2 — коэффициент соответствия между 1 шкалы поляриметра и содержанием сорбозы в г/100 мл;

P — показания поляриметра;

К вЂ” величина угла вращения кварцевой трубки;

2 — коэффициент пересчета на нормальную навеску.

Глубину окисления сорбита в сорбозу 7. вычисляют по формуле

С 100

Х

В ( где С вЂ” содержание сорбозы в г/100 мл окисленного раствора,  — содержание сухих веществ в г/100 мл окисленного раствора, определенных по рефлектометру..

В качестве контроля используют те же условия выращивания уксуснокислых бактерий, но ДНКазу добавляют в питательную среду, инактивированную путем нагревания при 100 С 10 мин.

Для подбора дозы ДНКазы, стимулирующей ра"множение бактерий, используют несколько концентраций ферментами

1 10 мл/г, 1 -10 мг/мл, 1-10 мг/мл.

При соблюдении всех описанных условий проведения опыта не обнаружено стимулирующего влияния ДНКазы в концентрации 1 10 мг/мл на размножение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбозу.

Не обнаружено также стимулирующего действия ДНКазы в концентрации

i-l0 мл/мл на размножение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбоэу.

Панкреатическая ДНКаза в концентрации 1 10 мг/мл способствует уско— рению размножения уксуснокислых бактерий. Данные о влиянии панкреатической ДНКазы на размножение уксус- нокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбоэу при выращивании Gl.oxydans в лабораторных условиях представлены в табл.i и выражены в процентах стимуляции по от-. ношению к контролю, принятому за !

007.

Как видно из табл.1,.уже через 3 ч. культивирования в среде с ферментом происходит ускорение размножения клеток на 28,97. Однако в этот период увеличение глубины окисления сорбита в опыте по сравнению с

876

Таблица 1

Время инкубации клеток с

ДНКазой, ч

Стимуляция раз- Стимуляция множения клеток, окисления сор»

Х бита, Х

28,9

3 ч

29,0

12 ч

25,0

24 ч

17,6

20,0

18,2

36 ч

10,3

48 ч

12,8

10,5

3 1162 кон:ролем не наблюдается. Наиболее высокого значения величина стимуля- ции размножения клеток и окисления сорбита в сорбозу (29 и 25Х сЬответственно). достигает через 12 ч роста культуры в присутствии панкреатической ДНКазы. На протяжении последующих 12 ч роста культуры стимулирующий эффект сохраняется, а к концу периода исследования уменьша- IO ется в два раза.

Таким образом, панкреатическая

ДНКаза, добавленная в питательную среду в конечной концентрации

1 ° 10 мг/мл стимулирует размножение клеток в лабораторных условиях культивирования Gluconobacter oxydans Стимулирующее действие ДНКазы сопряжено с усилием процесса окисления сорбита в сорбозу. щ

II р и M e p 2. Выращивание уксуснокислых бактерий в производственных условиях в прединокуляторе при добавлении в питательную среду панкреатической ДНКазы в конечной

-ь концентрации I --10 — 2-10 мг/мл (1 10 — 2. 10 мг/л среды ).

С целью накопления биомассы в производственных условиях уксуснокислые бактерии выращивают поэтапно, начиная с меньшей емкости— прединокулятора (100 м ), и завершая процесс ферментации в емкостях

10000- 13000 л.

В прединокуляторе культуру выращивают в течение 12 часов. Ос- 35 новным тестом, определяющим жизнедеятельность бактерий и позволяющим перейти к слецующему этапу выращивания клеток в больших емкостях, является глубина окисления сорбита в сорбозу этими бактериями, которая через 12 ч должна быть не менее

25-30Х.

При выращивании культуры в пре— динокуляторе емкость заливают 60 л питательной среды, засевают 48-часовой клеточной суспензией, выращенной в лабораторных условиях, из расчета IOX на объем среды. Одновременно с инокулятом вводят панкреатическую ДНКазу.

Через каждые 3 ч роста культуры из прединокуляторов отбирают пробы для определения влияния панкреатической ДНКазы на глубину окисления сорбита в сорбоэу. Результаты исследований представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что выращивание клеток в прединокуляторе в присутствии ДНКазы в течение 9 ч приводит к стимуляции .окисления сорбита в сорбозу на 40-60Х. Через 12 ч роста культуры стимулирующий эффект уменьшается, однако сохраняется на уровне 14-28Х. Полученные результаты позволяют заключить, что ДНКаза; добавленная в среду культивирования, положительно влияет на жизнеспособность уксуснокислых бактерий. Глубина окисления сорбита в сорбозу через

9 ч выращивания бактерий в среде с

ДНКазой достигает 25-30Х, что позволяет перевести культуру из прединокулятопа в следующую емкость (инокулятор ) и, следовательно, сократить продолжительность выращивания клеток в прединокуляторе на

3 ч.

1162876

Таблица 2

Прединокулятор

Глубина окисления сорбита в сорбозу через

12 ч роста клеток

9 ч роста клеток

Опыт

Контроль Стимуляция,%

Опыт Контроль Стимуляция,%

29,5 17,5 67,0

30,5 21,5 42,0

58,0 49,8

53,2 41,3

5l,7 44,8

56,9 49,7

16,0

28,0

23,6

24 9 16 1 54 0

28,2 23,2 69,0

14,5.

Составитель 3. Голимбет

Техред Л.Коцюбняк Корректор С.Черни

Редактор О.Бугир

Заказ 4065/25 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðoä, ул.Проектная,4

П р и м е ч а н и е:Процент стимуляции выражен по отношению к контролю, принятому,за 1СОХ.

Контроль - глубина окисления в соответствующих прединокуляторах без ДНКазы.