Способ определения активности @ -лизин- @ -оксидазы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ L-ЛИЗИН-оС-ОКСИДАЗЫ путем культивирования гриба рода Trichoderina, центрифугирования водного экстракта культуры гриба, внесения в реакционную смесь водного экстракта культуры гриба буферной смеси, L-лизина, пероксидазы, 0-дианизидин-гидрохлорида и последующего спектрофотометрирования окрашенного продукта реакции , отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве буфера используют 0,05 М фосфатный буфер рН 5,7-5,9 при концентрации L-лизина 0,5 мМ.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (! 1) 4 (51) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3584374/28-13 (22) 21 ..04. 83 (46) 23.06.85. Вюл. 0- 23 (72) И.П. Смирнова, Т.Т. Березов и С.П. Сяткин (71). Университет дружбы народов им . П. Лумумбы (53) 543.866 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У .1047957, кл. G 12 Q 1/00, 1983. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ L-ЛИЗИН-<-ОКСИДАЗЫ путем культивирования гриба рода Trichoderina, центрифугирования водного экстракта культуры гриба, внесения в реакционную смесь водного экстракта культуры гриба буферной смеси, L-лизина, пероксидаэы, 0-дианизидин-гидрохлорида и последующего спектрофотометрирования окрашенного продукта реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве буфера используют 0,05 И фосфатный буфер рН 5,7-5,9 при концентрации L-лизина 0,5 мМ.

В качестве катализатора пероксидазной реакции используют пероксидазу фирмы "ReanaI" в качестве донора протонов — 0-дианизадингридрохлорид (фирма "Merck", ФРГ) . 3a единицу активности принимают количество фермента, катализирующего образование мк/моль H О за 1 мин при 37 С.

Удельную активность фермента выражают числом единиц активности на 1 мг белка или на 1 мл водного экстракта культуры. Белок определяют по методу Лоури.

Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют спектрофотометрически при 540 нм. Количество образующейся культуры в 1 мин в стандартных условиях рассчитывают по калибровочному графику.

При исследовании Trichoderina

heizzianum Rifai оптическая плотность исследуемой пробы 0,110, т.е. количество Н,О,, которое образовано, равно 90 нмоль. Удельная активность фермента на 1 мл водного экстракта равна 90 ед.

B таблице приведены сравнительные данные по определению активности Ь-лизин- (-оксидазы известным и предлагаемым способами в разных культурах рода Trichoderina

1 1163268 г

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биохимическим способам определения активности ферментов, в частности L-лизин-а -оксидазы и может быть применено в микробиологии, биохимии, медицине, ферментной промьппленности.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Пример. Культуру Trichode- 10

ring sp, выращивают в колбе на

250 мп на ср еде, содержащей NaN03

11,4Х (14 мп) пшеничные отруби 10 г и дистиллированную воду 10 мл.

Культуру выращивают в течение 1

14 дней при 28 С. Затем в колбу добавляют 100 мл стерильной Н О и в течение 2 ч культуру встряхивают, отжимают через ткань и центрифугируют. Активность L-лизин- -оксидазы 2р в водном экстракте культуры рассчитывают по приросту.

Инкубационная смесь содержит в

1 мл

Фосфатный буфер 50,0 мк/моль (0,05 М)

L Лизин 0,5 мк/моль (0,5 мМ)

Пероксидаза 20 мкг

0-Диани30 зидин-гидрохлорид 250 мкг

Водный экстракт О 1-0 5 мг белка.

У У

После 20 мин инкубирования в ультратермостате при 37 С пробы охо лаждают до 4 С и добавляют 1 мл концентрированной НСЕ для прекращения реакции (НС предварительно охлаж- 40 дается до 0-4 ) . Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряют на спектрофотометре.СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Для построения калибровочной кривой молярность свежеприготовленного раствора Н О определяют перманганатометрией. Строят калибровочную кривую по Н,О . Субстратами служат

L-лизин и DL-лизин (фирма "ReanaI", Венгрия). Применяют 0,05 М фосфатный.

Пр едлагаемый способ, ед.

Известный способ,ед

Название культур

Тгдсйойех1па Hezzianum

Rifai

12,5

Trichoderina koningi

0nd BKNF — 1283 О

1,3

Предложенный способ обеспечивает повышение точности определения фермента на порядок, а также возможность определения активности у штаммов-продуцентов не только с выраженной активностью фермента, но и у тех, где эта активность ранее не выявлялась.