Способ разделения смеси фитогормонов

 

Изобретение относится к медицине , точнее к способам получения и разделения фитогормонов, регулирующих процессы роста и развития микроорганизмов низших и высших растений. Цель изобретения - ускорение способа и повышение точности разделения. Для этого в качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса 6-25,сиЛикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала, в соотношении

Взамен ранее изданного

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (5D 4 С 01 N 3.3/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬП ИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3547649/28-14 (22) 26.01.83 (46) 30.08.87. Бюл. У 32 (71) Институт физиологии и биохимии растений АН МССР (72) И.И.Гаврилюк (53) 612.396.1(088.8)) (56) Кефели В.И. и др. Методы определения фитогормонов, ингибиторов . роста, дефолиантов и гербицидов, М., Наука, 1973, с. 7-21. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ФИТОГОРМОНОВ (57) Изобретение относится к медици.не, точнее к способам получения и разделения фитогормонов, регулирующих процессы роста и развития микроорганизмов низших и высших растений.

Цель изобретения — ускорение способа и повышение точности разделения. Для этого в качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса 6-25,силикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала, в соотношении (63-76):(10-19):(10-14):

:(5-8) (мас. Ж). Хроматографию фитоо гормонов проводят при 20-22 С, используя подкисленный 807-ный водный этанольный раствор свидетелей. Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере. Для разделения кинетика, индолилуксусной, гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей: н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении (28-32):(47-57):(5-7):(10-14) (об.Ж).

Для качественного определения фитогормонов слой адсорбента обрабатывают

0,004-0 005Х-ным водным раствором флуоресцеина, парами брома и освещают ультрафиолетовым светом. 1 табл.

11645

Растворитель: н-бутанол, пропанол, аммиак, вода (28:57:5:10 об. Х) Соедине ния

Индолилуксусная кислота

0,41

Гибберелловая кислота

0,51

Абсцизовая кислота

0,65

0,77

Кинетин

Изобретение относится к области медицины, а именно, к способам получения и разделения фитогормонов pery лирующих процессы роста и развития

5 микроорганизмов, низших и высших растений.

Целью предложения является ускорение способа и повышение точности разделения. 10

Пример 1. В качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса G-25, силикагеля с люминесцентным индикатором

УФ и крахмала в соотношении 63 . 15г 15

:14:8 (мас.X). Сефадекс, силикагель, крахмал и целлюлозу последовательно в отдельности суспендируют в деиони- . эированной воде (Ha 15 г смеси берут

60 мл воды). После суспендирования 20 каждого компонента смеси суспензию размешивают 1 мин. Указанное количество адсорбента достаточно для приготовления 10 пластинок. Для приго» товления пластинок со слоем комбини- 25 рованного адсорбента используют стеклянные обезжиренные фотопластинки (23,7 х 8,7 см). Полученную сорбционную массу наливают на.пластинки и сушат в строго горизонтальном поло- 30 жении на воздухе не менее 3 ч. Получают слой толщиной 100 мк. Пласо тикки активируют при 90 С..в течение

15 ч. Хроматографию фитогормонов проо, водят при 20-22 С. Растворы наносят микрошприцом. Для хроматографирования фитогормонов используют подкисленный 80Х-ный водный этанольный раствор свидетелей (из расчета 0,5 мл

НС1 на 10 мл спирта). На пластинку 40 наносят пробы различных количеств смеси, по 1-3 мкл раствора, содержащего от 17 до 64,5 мкг фитогормонов. После нанесения растворов стартовую линию подсушивают феном в те- 45 чение 2-3 мин.

Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером

150 х 150 х 200 мм. Расход растворителя составляет примерно 80 мл. Для 50 разделения кинетина, индолилуксусной гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении 28:57:5:10 об.Х.

Систему растворителей пропускали восходящим током при подъеме ее на

21 см от линии старта. Разделение фитогормонов на комбинированном ад98 г сорбенте происходит за 2,5 ч. Хрома-, тограмму подсушивают феном и выветривают до исчезновения запаха растворителя. Для качественного опреде-. ления фитогормонов используют комбинированный проявитель — слой опрыскивают 0,005Х-ным водным раствором флуоресцеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хроматограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темно-фиолетовую окраску. Значения R фитогормонов на комбинироf ванном адсорбенте приведены в табл.

Значения R (х 100) фитогормонов на комбинированном адсорбенте

Пример 2., Свежесобранный растительный материал неоднократно экстрагируют подкисленным 80Х-ным метиловым спиртом (из расчета 0,5 мл на О, 1Н НС1 на 100 мп спирта) . Растительную вытяжку упаривают до небольшого объема. На готовые пластинки диаметром 23,7 х 8,7 см, покрытие комбинированным адсорбентом (целлюлоза — 69,5; сефадекс — 12,5; силикагель — 11,5, крахмал — 6,5 мас. Х), микрошприцом наносят одновременно на стартовую линию растворы анализируемых образцов и свидетелей. Объемы нанесенных растворов равняются 1

5 мкл, что является оптимальными объемами.

Отдельно готовят два раствора свидетелей с различным процентным содержанием фитогормонов. Первая смесь

1164598

Составитель А.Агуреев

Редактор П.Горькова Техред М,Пипык Корректор В.Гирняк

Заказ 3987/3 Тираж 776 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 свидетелей объемом 1 мкл содержит

17 мкг (1 мкг индолилуксусной кислоты, по 4 мкг гибберелловой и абсцизовой кислоты, 8 мкг кинетина).

Вторая смесь свидетелей объемом i мкл содержит соответственно 34 мкг фитогормонов (2 мкг индолилуксусной, по

8 мкг гибберелловой и абсцизовой кислот, .16 мкг кинетина).

Хроматографию проводят в герметичной стеклянной камере. После разделения в системе растворителей: н-бутанола, пропанола, аммиака и воды (30:52:6:12 об.Х) и проявления пятен на пластинке в принятых условиях проводят количественный анализ фитогормонов. Для этого используют алгебраический метод Пурди и Трутера, -основанный на зависимости между площадью пятна и его массой. В тычинках цветков яблони этим методом обнаруживают на 3 г сырого материала 5 мкг индолилуксусной, 3 мкг гибберелловой кислоты, 2 мкг кинетина и три неидентифицированных цитокинина..

Пример 3. 2 г лиофилизированных трехдневных проростков пшеницы экстрагируют подкисленным 80Х-ным метиловым спиртом (О, 1 л, 3 ч при

20 С). Спиртовой экстракт отделяют от осадка и упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл 95Х-ного этилового спирта. На пластинку, покры- тую комбинированным адсорбентом: целлюлозой, сефадексом G-25, силикагелем с люминесцентным индикатором

УФ и крахмалом в соотношении

76:10:9:5 мас,Х, наносят исследуемый и эталонный растворы. Разделение проводят на комбинированном адсорбенте в системе н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении

32:47:7:14 об.X. После проявления пятен 0 005Х.-ным водным раствором флуоресцеина на пластинке проводят

5 .качественный анализ фитогормонов ° В проростках пшеницы обнаружены гибберелловая и индолилуксусная кислоты, а также вещество цитокининовой природы.

10 Использование способа позволяет в 18-20 раз ускорить процесс разделения при большей четкости деления.

Формула изобретения

Способ разделения смеси фитогормонов, включающий нанесение смеси на адсорбент с последующим разделением в системе растворителей и проявле20 нием в ультрафиолетовом свете, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения точности разделения, в качестве адсорбента используют смесь целлюлозы, 25 сефадекса, силикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала при соотношении ингредиентов, мас. X:

Целлюлоза 63-76

Сефадекс 10-15

30 Силикагель 9-14

Крахмал 5-8 а система растворителей включает! н-ВиОН пропанол, аммиак и воду при соотношении, об. Х: н-BuOH 28-32

Пропанол 47-57

Аммиак 5-7

Вода 10-14, причем для проявления компонентов

40 слой адсорбента обрабатывают водным . раствором флуоресцеина с концентрацией 0,004-0,005 мас. Х, а затем парами брома.