Способ получения липосом
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ путем обработки липидбв ynijTpasByKOM от л и ч. а ю щ и и с я тем, что,, с целью повышения устойчивости липо-. сом к действие физико-химических факторов, дипиды озонируют 5-30 мин при концентрации озона 10-100 мг/м.
„„SU„„1 65709 А
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИ4ЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
4(н) С 11 В 1/10
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТНРЫТИЙ 1 Ж ®щЗЩ
J с !,, т
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 35 42156/28-1 3, {54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОИ (22) 10.01.83, путем обработки липидов ультразвуком (46) 07. 07. 85,. Бюл 9 25 отличающийся тем, что, . (72) Л, К. Герасимова, Г.Н. Семенкова, с целью повынения устойчивости лино=
А.И.Хмельницкий и С.Н.Черенкевич сом к действию физико -химических (71) Белорусский ордена Трудового факторов, липиды озонируют 5-30 мин
Красного Знамени государственный при концентрации озона 10-100 мг/м3 . университет нм. В.И.Ленина (53) 615.1(088.8) (56) .Rscker H.А; "Biachem. Biop hys.
Res. Comm. 1973, 55, Р 1, 224-230.
1 11657
Изобретение относится к химической технологии высокомолекулярных соединений, конкретно к способу получения липосом, и может быть использовано в химической промышленности и медицине, а также в научно-исследовательских и учебных лабораториях для получения в аналитических и препаративных целях липосом из липидов растительного и животного происхожде- 1О ния.
Целью изобретения является повышение устойчивости липосом к действию физико-химических факторов.
П-р и м е р 1. Липосомы пригото- 15 вили следующим образом, g,5 мл 107ного спиртового раствора лецитина яичного желтка подвергли вакуумной— сушке, суспендировали в 5 мл дистиллированной воды. Полученную суспен- 2б зию обработали озоном концентрации
50 мг/м в течение 20 мин и провели зкстракцию хлороформом в отношении
1:1. Затем хлороформрастворимую фракцию подвергли вакуумной сушке, пере- 25 вели в водную фазу РН 6,0 и обработали ультразвуком мощностью 5 Вт/см в течение 5 мнн в режиме стоячих волн.
Образование липосом контролировали с помощью методов светорассеяния и электронной микроскопии.
Данный метод пригоден для приго" товлепия .устойчивых липосом из липидов как,растительного, так и живот35 ного происхождения.
Пример 2. На флуориметре измеряли интенсивность люминесценции при h=460 нм липосом, полученных по примеру 1 и липосом получен 4р ных известным способом, в зависимости от сроков хранения при естественном освещении в комнатных условиях.
В табл. 1 представлен сравнительный анализ изменения интенсивности флуоресценции (h=460 нм) липосом, полученных предлагаемым (I ) и известным (Х„) способами.в процессе хранения. при комнатной температуре (А), при действии температуры (Б), 5О при действии УФ-излучения .(В), при действии перекиси водорода (Г).
Из табл. 1(А) видно, что интенсивность люминесценции липосом, полученных известным способом (контрольные липосомы), растет со временем хранения, что свидетельствуют об увеличении концентрации продуктов окисления липидов в данных липосомах и, следовательно, об увеличении степени окисленности самих липосом. В то же время интенсивность люминесценции липосом, полученных предлагаемым способом, остается практически постоянной, т.е. липиды в них окисляются в течение длительного срока хранения, следовательно, сами липосомы более устойчивы к длительному хранению.
Пример 3. Последовательность операций такая же, как в примере .
Концентрация озона 50 мг/м, время озонирования 20 мин. Измеряли интен сивность флуоресценции липосом при ,температурах суспензий 20, 40, 60 С. ,Полученные результаты представлены в табл. 1 (Б), откуда следует, что при повышении температуры интенсивность флоуресценции контрольных липосом растет, что свидетельствует об увеличении степени окисления липидов в липосомах, следовательно, и самих липосом. Для липосом, полученных предлагаемым способом, интенсивность флуоресценции практически не изменяется при повышении температуры и сохраняется устойчивость даже на 30 сутки хранения при 60ОС, в то время как контрольные липосомы практически полностью разрушены.
Пример 4. Последовательность операций такая же, как в примере
Концентрация озона 5 мг/м, время оэонирования 30 мин. Липосомы подвергли действию УФ-излучения от лам- пы ДКСШ-1000 в течение 10 мин, а затем измеряли интенсивность флуоресценции через 0 ч, 1 ч, 1 сут,.10 сут
30 сут после действия УФ-излучения.
Полученные результаты представлены в табл. 1 (В) °
Из сравнения результатов видно, что интенсивность флуоресценции липосом, полученных предлагаемых способом и подвергшихся действию УФ-излучения, практически не меняется .в течение 30 сут, в то время как степень окисленности контрольных липосом значительно увеличивается со временем хранения.
Таким образом, липа сомы, полученные предлагаемым способом, являются более устОйчивыми к воздействию
УФ-излучения.
Пример 5. Последовательность операций осуществляли, как в приме709 з 1165 ре 1. При получении липосом озонирование осуществляли в течение 5 мин с концентрацией озона 100 мг/м .
К липосомам добавляли перекись водо рода (концентрация перекиси водорода . в суспензии липосом 0,57). Измеряли . интенсивность флуоресценции через
0 ч, 1 ч, 1 сут, 10 сут, 30 сут после добавления перекиси водорода.
Полученные результаты представле- 10 ны в табл. 1 (Г). Из сравнения результатов следует, что липосомы, полученные предлагаемым способом более устойчивы к.перекисному окислению.
Интенсивность флуоресценции липосом при 3=460 нм характеризует устойчивость к внешним воздействиям химического состава соединений, в частнос. ти липидов, образующих липосомы.
Наличие и устойчивость липосомы как gp
° целого характеризует интенсивность
О светопропускания при Ь =6327 А и по-. тенциал электрического пробоя.
Пример 6. Для измерения интенсивности светопропускания при Д= 25 о
=6327 А на нефелометре был осуществлен последовательно ряд экспериментов, аналогичных примерам 2-5.
В табл. 2 представлен сравнитель ный анализ измерения интенсивности светопропускания при 3=6327 А липосом, полученных предлагаемым (Х ) и известным (I„) способами, в процессе хранений при комнатной температуре (А),. при действии температуры (Б) ° при действии УФ-излучения (В), при,:, действии перекиси водорода (Г).
Из табл. 2 следует, что липосомы, полученные известньв способом, при нагревании до 60 С сохраняют свою . 4О устойчивость не более 10 дней, в то время как липосомы, полученные предлагаемым способом, сохраняют свою устойчивость 30 сут и более.
При УФ-воздействии на 30 сутки сохраняют устойчивость 557. лицосом, полученных известным способом, и 95Ж липосом, полученных предлагаемым способом. Аналогичная тенденция сохраняется и при воздействии перекиси @ водорода.
Из этого следует, что липосомы, полученные предлагаемым способом, являются более устойчивыми, чем контрольные липосомы.
Пример 7. Для оценки устойчивости к прикладываемому электрическому напряжению измерен потенциал пробоя фрагментов липосом, полученных известным и предлагаемым способами при длительном хранении.
В табл. 3 представлен сравнительный анализ изменения потенциала при- . боя фрагментов липосом, полученных предлагаемым (U ) и известным (U„) способами в процессе хранения, откуда следует, что потенциал пробоя, а следовательно, и устойчивостЬ липосом, полученных предлагаемым способом втрое выше липосом, полученных известным способом.
Пример 8. На практике - acro возникает необходимость использования липосом для "упаковки" (включения внутрь липосомы) легкоразрушаемых биологически .активных веществ (микро. капсулирование) с целью длительного хранения. Невысокая устойчивость ли(посом, получаемых известными способами, не позволяет защищать от окисле-.
"ния биологически активные вещества более чем на 100 мин. Липосомы, полученные предлагаемым способом, защицают от окисления биологически активные вещества в течение 600 мин и бо- . лее.
В табл. 4 приведены значения оптических плотностей поглощения полиенового антибиотика айфотерицина В (гептаен) при 6=412 нм, заключенного в ли. посомы, полученные предлагаемым D> и известным В,„ способами.
Значительное снижение оптической плотности гептаена в липосомах, полученных известным способом, свидетельствует о значительной степени окисленности этого вещества, что обусловлено низкой устойчивостью укаэанных липосом по сравнению с липосомами, полученными предлагаемым способом.
1165709
Таблица1
Интенсивность флуоресценции (относительная Х)
1 1 I
Показатели Способ
Оч 1 ч 1 сут 10 сут 30 сут
Температура
103
101
130
102
148
105
115
Разрушены
223
102
103
В
240
УФ-излучение
200
115
109
Перекись водорода
240
210
Таблиуа2
Интенсивность светопропускания (относительная Ж) Показатели Способ
0 ч 1 ч 1 сут 10 сут 30 сут
Температура, С
99
А
Хк
Хр.
62
Хк
90
6.0
100 100 91
Разрушены
Х„
Хр 100 100
УФ-излучение
74
100
Х
Перекись водо-, рода I g
90
100 82
76
Хр 100 100 100
I 1, 100 103 107
Хо 100 1 00 100
I 100 105 115
Iî 100 100 102
I 100 108 130
Хр 100 . 100 101
Хк 100 120 155
I 100 103 106
Iê 100 170 190
100 100 100
100 100 98
100 100 100
100 100 97
Хр 1 00 1 00 . 98
Б
190
1!65709
Таблица3
0 ч 1 ч 1 сут .
30 сут.
10 сут
По тенциал
270 270
90 100
V (мВ)
Ч (мВ) 290
270
290
120
130
Таблиц а 4
Оптическая плотность О мин 10 .мин 30 мин 100 мин
0 89 . 0 75
1,0
0,95
0,98
1,0
0,40
0,65
0,95
0,80
Способ получения липосом
Количество разрушенных липо сом X.
Нагрева- УФ-облучение ние
Предлагаемый
Концентрация озона 10 мг/м 5
Время озонирования 5 мин
Концентрация озона 5 мг/м 17 .
Время оэонирования 2 мин
25
Известный
Пример 9. При получении липосом осуществляли озонирование липидов при следующих условиях: концент- 25 рация озона 100 мг/м, время озонирования 30 мин; концентрация озона
200 мг/м, время оэонирования 40 мин.
Выделяли хлороформрастворимую фракцию выход которой определяли взвеши- 5в ванием, При использовании эапреде..ьных значений озонирования выход хлороформрастворимой фракции уменьшился на 507., а следовательно, количество . получаемых липосом уменьшается также вдвое.
Следовательно, озонирование липидов в концентрации выше 100 мг/м в течение времени больше 30 мин нецелесообразно, так как приводит, щ к значительному снижению выхода липо/сом.
Пример 10, Получали липосомы: при следующих условиях: концентрация 1 озона 10 мг/м, время озонирования
5 мин (нижний граничный предел); концентрация озона 5 мгНм, время озонирования 2 мин (нижнее запредельное значение).
Сравнивали полученные предлагаемым способом липосомы с липосомами, полученными известным способом, на устойчивость к нагреванию (e =60 С в течение 20 ч) и УФ-облучению (лам55 па ДКСШ-1000 в течение 40 мин) методами светорассеяния и люминесценции, Полученные результаты представлены в табл. 5.
Таблица5
Из табл, 5 видно, что использование концентрации озона ниже 10 мг/м и времени озонирования меньше 5 мин нецелесообразно, так как устойчивость получаемых липосом,значительно снижаатся.
