Способ определения общего холестерина в сыворотке крови

 

С1ЮСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОНЦЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестериноксидазой , отличаю щийс я тем, что, с целью пов1 ш1ения точности определения, в качестве холестерйнэстеразы используют ацетоновьй сухой порошок или обогащенную холестерннэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa АТС С 14830 или Rhisopus spec. (WS 90027), которую берут в соотношении 1 - 10 ч. на 1 мл сыворотки. § О)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (1% (И) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2012029/28-13 (22) 28.03.74 (31) P 2315501.3 (32) 28.03.73 (33) DE (46) 15.07.85. Бюл. Ф 26 (72) Клаус Бойкамп, Ханс Меллеринг, Гюнтер Ланг, Вольфганг Грубер и Петер Решлау (bE) (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (53) 616.07 (088.8) (56) Biochimia Biophisica, Acta, 270 (1972), 156-166 (прототип); (у) С 01 N 33/48 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО

ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестериноксидазой, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве холестеринэстераэы используют ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa

АТС С 14830 или Rhisopus арес. (WS

90027), которую берут в соотношении

10 ч. на 1 мл сыворотки.

1168103

Actinomyces

verticilium

Actinomyces . ofuscatus

Асtinomyces

mycini

Actinomyces

porus-fl

Actinomyces

t.1cus

Actinomyces

aureoñóànågr seoLongismalachiroseolus

MS 90002

WS 90003

Ы 90004 WS 90005 55

MS 90006

MS 90007

Изобретение относится к области медицины, . именно к способу опреде ления общего холестерина или связанного холестерина в сыворотке .1 крови. 5

Известен способ определения общего холестерина в сыворотке крови путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холес- 10 теринэстераэой (1) .

Цель изобретения — повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе- 15 ния общего холестерина в сыворотке крови путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестеринэстеразой, в ка- 20 честве холестеринэстеразы используют ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa

АТС С 14830 или Rhisopus врес. (MC 25

90027), которую берут в соотношении

1 — 10 ч. на 1 мл сыворотки.

Способ осуществляют следующим образом;

Используют холестеринэстеразу из 50

Candida rugosa (называемой также ,Cylindracea) ATCC 14830 или MC 9003 1

1 и Aspergillus spec. WS 90030. Оба эти микроорганизма могут применяться непосредственно или в растворенной форме, например, как-ацетоновый сухой порошок. Возможно применение препарата, насыщенного холестеринэстеразой, из этих микроорганизмов, причем преимущественно состоит в том, что простым путем можно достичь определенного насыщения. Обычная форма представляет собой стабилизированный лактозой ацетоновый сухой порошок. Подобные благоприятные свайства найдены у следующих препаратов:

Наряду с предпочтительными холестеринэстеразами микробиологического происхождения могут применяться . также холестерннэстераэы другого происхождения.

Преимущество способа сосотоит в том, что возможно полное ферментатив" ное определение общего холестерина.

При этом имеет значение то, что при помощи препаратов холестеринэстера зы из микроорганизмов возможно быстрое и количественное освобождение холестерина из его сложных эфиров.

В частности, при помощи указанных микроорганизмов можно добавлением последних достигнуть в течение нескольких минут количественного высвобождения холестерина, Установлено, что обычные стабилизаторы на основе углевода, которые применяют для таких микроорганизмов, в рамках ферментативного способа определения холестерина не влияют на результат определения.

Для осуществления способа можно применять обогащенную холестеринэстеразу, преимущественно из микроActinomyces toxytricini

Actinomyces variabilis

Streptomyces spec.

Streptomyces autotrophicus

Streptomyces canescens

Streptomyces chartreusis

Streptomyces michiganensis

Streptomyces murinus

Streptomyces hachijoensis

Stxeptomyces caelestes

Streptomyces tendae

Nocardia rubra

Candida mycoderena

Candida albicans

Candida albicans

Candida albicans

Candida spec.

° Cunninghamella elegans

Mucor mucedo

Rhizopus spec.

Penicillium. spec.

Aspergillus spec.

WS 90008

WS 90009

WS 90010

MS 90011

WS 90012

MS 90013

WS 90014

WS 90015

MS 90016

WS 90017

MS 90018

WS 90019

WS 90020

WS 90021

MS 90022

WS 90023

WS 90024

MS 90025

WS 90026

MS 90027

MS 90028

MS 90029 з 1168 организмов. Соответствующее обога- :« щение можно достигнуть исходя из ацетонового сухого порошка микроорганизма или другого биологического материала, подвергая его диализу, обработке слабоосновной.анионообменной смолой и фракционированию с сульфатом аммония. Таким путем легко достигают 20-30-кратное обогащение холестеринэстеразы.

Особенно благоприятные результаты получены с микроорганизмами, которые выращивались на содержащей холестериновый эфир питательной среде. При этом холестериновый эфир или смесь холестериновых эфиров может добавляться во время выращивания как единственный источник углерода или применяться вместе с другим источником углерода. Особенно пред- 2р почтительны микроорганизмы, которые получены многостадийным способом культивирования, причем они культивируются в первой стадии на соответствующем поставщике углерода, как глицерин, и во второй стадии на холестериновом эфире.

Холестеринэстераэа иэ Candida

rugosa АТСС 14830 имеет в слабокислой области между рН 5 и 6,5 очень хорошую стойкость. Оптимум рН фермента 7 5. Характерная особенность фермента заключается в том, что особенно каталитическая реакция происходит при сравнительно высоком содер35 жанни соли в реакционной среде.

Поэтому преимущественно работают с буферным раствором 0,2-0,8 И, осо- . бенно 0,4-0,6 М. Величина рН может быть 4,5-7,5, преимущественно 5-6,5.

Активность холестеринэстеразы повышается при добавлении поверхностно-активных веществ, особенно гидро" ксиполиэтоксидодекана.

Последующее определение холестерина производят ферментативно, .нреимущественно с применением холестериноксидазы. Можно применять. также холестериндегидраэу или холестериндегидрогеназу.

Определение посредством холестериноксидазы по известному способу можно комбинировать с данным способом. При этом можно измерять расход кислорода, образование Н20 или образование холестенона.

Расход кислорода можно определять, например методом газовой хроматогра103 4 фин, полярометрическим или поляризационным методами. Образованную. перекись водорода можно определять титрометрическим, потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим методами, а также ферментативным. Предпочтительно ферментативное определение с применением каталазы или пероксидазы, особенно определение посредством каталазы в присутствии Р -дикетонов, как ацетилацетон, низших спиртов и содержащего ионы аммония буферного раствора, илн определение посредством пероксидазы в присутствии хромогена, как

2,2 -аминобензтиазолинсульфокислота.

Холестенон определяется при помо-.. щи кетореактивов, например 2,4-динитрофенилгидразина, или фотометрическим методом при 240 нм.

Пример 1. В сыворотке с применением известного способа определяют содержание свободного.холестерина 63 мг Е (63 мг в 100 мл).

Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сыворотки о обрабатывают при 70 С раствором едкого кали в спирте. После нейтрализации и повторного измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мг Ж.

Отсюда следует, что 119 мг холестерина 100 мл были в связанной форме.

Способ повторялся с необработан-. ной сывороткой, однако к началу определения добавляли 0,3 мг (в пересчете на протеин) Candida rugosa

АТСС 14830 — сухого .ацетонового порошка в торговой форме. Через 3 мин полярографическое определение показало содержание общего холестерина

183 мгЖ.

Пример 2. Для увеличения активности холестеринэстеразы аце-тоновый сухой порошок Candida rugasa

АТСС"14830 растворяют в буферном растворе с фосфатом калия при рН 6 0 и подвергают диализу относительно того же буферного раствора. После удаления содержащейся в качестве стабилизатора.лактоэы в подвергнутом диализу растворе получают специфическую активность холестеринэстеразы 0,3 ед/мг протеина.

Полученньил таким путем раствор смешивают с модифицированными группами диэтилаж ноэтанола ионообменником на основе декстрана, ионит

1168103

t0

2S

ЗО

33

46

45 отделяют и элюируют при помощи

0,2 М буферного фосфатного раствора при рН 6,0. В элюате получают специфическую активность холестеринэстеразы 1,2 ед/мг.

Полученный таким путем pacTBop . подвергают фракционированию с сульфатом аммония. Осаждающую протеиновую фракцию между 1,8 и 2,4 M сульфатом аммония отделяют. Она имеет сйецифическую активность холестерин-. эстеразы 2,5 ед/иг.

Полученный таким образом продукт снова растворяют в фосфатном буферном растворе с рН 6,0, подвергают диалиэу относительно того же буферного раствора до удаления соли и затем хроиатографируют на колонне, заполненной такой же аниоиообменной смолой, как указано. Снова производят элюирование посредствои 0,2 M фосфатного буферного раствора с рН

6,0. Во фракции с активностью хо. лестеринэстеразы получают специфичес кую активность 7 ед/мг протеина.

Полученный таким путем обогащенный препарат холестеринэстеразы применяют для определения холестерина.

Однако введенное количество только

0,001 мг в пересчете на протеин.

Результат соответствовал примеру 1.

П.р и м е р 3. К 0,5 мл сыворотки или холестеринового эталона добавляют 1,0 мл 0,5 М буферного раствора с фосфатом калия при рН

7,5, который содержит 0 ° 4Х гидроксиполиэтоксидодекана, и 2,5 ед холестеринэстеразы по примеру 2. Зта реакционная смесь инкубируется в . течение 40 мин при 37 С. После этого 0,25 мл этого раствора добавляют к 3 мл холестеринового реактива, который содержит 2 ч. уксусной кис лоты, 3 ч. уксусного ангидрида и

1 ч. серной кислоты (реактив Либермана-Вурхардта) .

Используя эталон как сравнительную величину, для типичной пробы находят 170. игХ общего холестерина.

Сравнительное .определение при омылении холестериновых эфиров посредствои раствора едкого кали в спирте дает величину 165 MrX.

П р и и е р 4. 0,02 мл сыворотки смешивают- с 10 мп 0,5 М буферного раствора с фосфатои кальция, который содержит 0 4Х гидроксиполиэтоксидодекана, и 0,2 ед холестеринэстеразы по примеру 2. Реакционный раствор инкубируют 60 мин при 37"С. После этого определяют экстинкцию (Е1) при 240 нм по показаниям соответствующего спектрофотометра, реакция начиналась с 0 1 ед стериндегидразы из Вгеч1Ьасйегъиш .

stегоlicum. Через 15 мин снова считывают по прибору экстинкцию (Е,). Концентрация образованного

Ь -холестенона и холестерина полу"

Ф чается из разности между первым и вторым отсчетом, учитывая молярный коэффициент экстинкции для А -хо+» лестенона при 240 нм. Измерение. типичной пробы показало 183 мгХ общего холестерина.

Сравнительное определение с холестериноксидазой (из Nocardia erythropolis) вместо стериндегидразы давало

181 мгХ общего холестерина.

П р и и е р 5. 10 г диаммонийгидрофосфата растворяют в 100 мл воды и при помощи 85Х-ной фосфорной кислоты устанавливают величину рН 7,0. Затем добавляют 10 ед каталазы. Полученным таким путем раствором доливают до 100 мл смесь

0,2 мл ацетилацетона, 10 мл метанола и О, 1 r гидроксиполиэтоксицодекана. В этот раствор добавляется

2,5 ед холестеринэстеразы из Rhiкорив spec. (WS 90027), 5 0 ил полученного таким путем раствора смешивают с 0,02 мл сыворотки или 0,02 мл холестеринового эталонного раствора с содержанием

200 мгХ холестерина. Делящиеся беэ . остатка количества содержащей сыворотку и содержащей холестериновый эталонный раствор пробы смешивают каждое с О, 1 ед холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при 37 С. Затем е красящее вещество измеряют при

405 нм фотометром, учитывая холостую величину пробы.

Содержание холестерина в содержащей сыворотку пробе, учитывая эталон как сравнительную величину, 154 мгХ всего холестерина. Контрольное определение посредством холестеринэстеразы из Candida rugosa

АТСС 14830 вместо холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027) давало такую.же величину.

Составитель Н. Хрусталева

Редактор О. Колесникова Техред А.Кикемезей

Корректор И. Самборская) Заказ 4447/56 Тираж.897

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-.35 ° Раувская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ позволяет быстро и.точно определить содержащее связанного холестерина в биологической жид1168103 8 кости, при этом возможно определение холестерина связанного в сложные эфиры.