Гидрохлориды 1-нитро-9-гидроксиалкиламиноакридинов, проявляющие противоопухолевую активность

 

Гидрохлориды 1-нитро-9-гидроксиалкиламиноакридинов общей Лормулы NH-CH(CH2)OH г где при R Н п 1,2 или З; при R . п 1, проявляющие противоопухолевую активность .

„„SU„„1168557 А

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (1) а С 07 D 219/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

И . где при R = Н п = 1,2 или 3; при К = С И и = 1у проявляющие противоопухолевую активность. (21) 3269605/23-04 (22) 14.04.81 (31) P 223740 (32) 23.04.80 (33) PL (46) 23, 07. 85. Бюл. В 27 (72) Барбара Высоцка-Скжэльа, Анджэй Льэдуховски и Чэслав Радэиковскн (РЬ) (71) Политехника Гданьска (Р1.) (53) 547. 835. 3 (088. 8) (56) Патент Великобритании

Р 1093844, кл. С 2 С, 1967.

Naterie Medice Ро1опе. 1976(8), s. 237-251. (54) ГИДРОХЛОРИДЫ 1-НИТРО-9-ГИДРОКСИАЛКИЛАМИНОАКРИДИНОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ

ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ . (57) Гидрохлориды 1-нитро-9-гидро" ксиалкиламиноакридинов общей Ьормуин-сн(сн,)„-ок о

1168557

Изобретение относится к производ ным 1-нитро-9-гидроксиалкиламиноакридинам общей формулы

10 где при R = Н п = 1,2 или 3 при R = С Н п = 1, а именно к их гидрохлоридам, проявляющим противоопухолевую актив15 ность.

Цель изобретения — получение новых соединений в акридиновом ряду, обладающих высокой противоопухолевой активностью.

Пример 1. 6,4 r 1-нитро-9-феноксиакридина растворяют в. 20 r фенола, добавляют 2 r хлоргидрата 2-аминэтанола, после чего подогревают при 80 С в течение 40 мин. После охлаждения смесь, полученную в ре25 зультате реакции, разбавляют эфиром и медленно выливают в излишек сухого эфира, подкисленного эфирным раствором хлористого водорода. Выпавший осадок фильтруется и промыва- З0 ется сухим эфиром и кристаллизуется из безводного этанола. Получают темно-желтые кристаллы хлоргидрата

1-нитро-9-(2-гидроксиэтиламино) акридина с т.пл. 170 С, с разложе- З5 нием. Выход 91Х.

Хроматографический анализ;

На нейтральной окиси алюминия

607254 (фирмы МегсЕ) по системе бензол:ацетон: метанол 3:1:1 Rg= 0,6. 40

На силикагеле (фирмы Merckf no системе бутанол:уксусная кислота:вода 4;1:1 R &,45 °

Вычислено,%: С 56,47, Н 4,42, N 13,17. 45

Найдено,X: С 56,44, Н 4,40;

N 13,03.

Пример 2. 3 16 r 1-нитро-9-феноксиакридина растворяют в 50

15 мл фенола,;добавляют 1 r хлоргидрата З-аминпропанола, после о чего подогревают при 60 С в течение 0,5 ч. После охлаждения смесь, полученную в результате реакции, растворяют в сухом бензоле и медленно выливают в излишек сухого бензола. Выпавший оранжевый осадок фильтруется, несколько раз промывается на воронке сухим эфиром и выкристаллизовывается из смеси этанол/эфир.

Таким образом, получают хлоргидрат

1-нитро-9-гидроксипропиламиноакридина с т. пл. 180 С, с разложением.

Выход 887.. . Хроматографический анализ.

На нейтральной окиси алюминия (Merck) rro системе бензол : ацетон метанол 3:1:1 Rg = 0,55. На силикагеле (Merck) по системе бутанол : уксусная кислота . вода

4:1:1 .Rg = 0,45.

Вычислено, X: С 57, 53; Н 4, 83;

N 12,58.

С„Н„О, N3C1

Найдено,X: С 57,63; Н 4,97;

N 12,43.

Пример 3. 3,9 r 1-нитро †9-феноксиакридина растворяют в 20 мл фенола, добавляют 1, 1 мл 2-амино-1-бутанола, после чего подогревают в течение 20 мин при 90 С. Затем смесь, полученную в результате реакции, медленно выливают в охлажденный эфир, часть растворителя отгоняют, а выпавший осадок кристаллизуется из смеси петролейный эфир/бензол. Получают основание 1-нитро-9(1-этил-2-гидроксиэтиламино) акридина с т.пл. 107 С. Выход 997, Основание затем переводят в хлоргидрат.

Хроматографический анализ.

На нейтральной окиси алюминия (Merck) по системе бензол : ацетон; метанол 3: 1: 1 Rg = 0,7.

На силикагеле (Merck) по системе бутанол : уксусная кислота : вода

4:1:1 R = 0,6.

Вычислено,X . С 58,67; Н 5,21;

N 19,08.

С„,Н„О,И,С1

Найдено,X: С 58,80; Н 5, 17;

N 11,84.

Пример 4. 6,4 r 1-ни"гро-9-феноксиакридина растворяют в

30 мл фенола, добавляют 2,4 г хлоргидрата 4-амино-1-бутанола, после чего нагревают смесь в течение 20 мин при 100 С. После охлаждения смесь, полученную в результате реакции, выливают в излишек (1,5 л) сухого охлажденного эфира. Выпавший оранжевый осадок кристаллизуется иэ метанола с добавкой эфира. Получают хлоргидрат 1-нитро-9(4-гидрокси1168557 бутиламино)акридина с т.пл.168 С

t с разложением. Выход 907.

Хроматографический анализ.

На нейтральной окиси алюминия (Merck) по системе бензол : ацетон : метанол 3:1: 1 R = 0,65.

На силикагеле (Merck) по системе бутанол : уксусная кислота : вода

4:1:1 Rg = 0,50.

Вычислено,7: С 58,67; Н 5,21;

N 12,08.

С Н уО И С1

Найдено,7: С 58,69; H. 5,20;

N 12,16.

Группа предлагаемых соединенийобладает противоопухолевой активностью, которая является подобной, а в большинстве тестов даже более высокой по сравнению с известными соединениями этой группы, кроме того, не проявляет рвотных свойств, а также не влияет на периферическую кровь. Это свойство необыкновенно редкое и ценное среди этой группы соединений.

Противоопухолевые свойства рассматриваемой группы соединений, а именно 1-нитро — 9-гидроксиалкиламиноакридинов, многократно исследуют тестами in vitro u in vivo, Метод in vitro .

Торможение прорастания семян сердечника — тест -роста.

На чашке Петри диаметром 80 мм по возможности равномерно размещают 20-25 семян сердечника на двух слоях промокательной бумаги, затем наливают 30 мл раствора исследуемого соединения с концентрацией

1 мгlмл, а на контрольные чашки дистиллированную воду. Чашки инкубируют в течение суток при 20-30 С, п6сле чего измеряют длину ростков.

Эффект торможения выражается в процентах уменьшения средней длины исследуемых ростков по сравнению с контрольными.

Процент торможения прорастания семян сердечника для рассматриваемой группы соединений составляет

87-94Х.

Метод Миямуры (раковые клетки

Эрлиха).

Метод состоит в определении торможения активности дегидрогенов раковых клеток Эрлиха (5 х 10 в мл) исследуемыми соединениями, мерилом чего является диаметр зоны невосстановленного окислительно-восст яновительного красителя (ресазурина), образовавшегося вокруг цилиндра с

1Ж-ным раствором исследуемого соединения после 5 ч инкубации при 37 С.

В соответствии с общепринятыми принципами соединения, для которых зона торможения составляет не менее

20 мм, считаются активными.

Предлагаемые соединения выявляют исключительно высокую активность по этому тесту, причем она составляет в среднем 31-33 мм.

Тканевая культура, так называе15 мая линия КВ.

Исследования проводят по методу тканевой культуры, разработанному

Иглем и Фоули, модифицированному

Смитом и его сотрудниками.

20 Опыт проводят на опухолевых клетках человеческого происхождения (линии КВ), с использованием питательной среды Игла с добавкой 10 телячьей сыворотки.

25 Тесты производят в пробирках с прививаемых клеток (40-80 тыс) взвеси (4 мл), что равнозначно- с

40-80 мг клеточного белка.

Рост культуры определяют приЗб ростом клеточного белка фотометрически с использованием реактива Фолина-Сикальтана методом, разработан.ным Оямой и др.

Одновременно с привитием пробирок клетками добавляют 0,9 мл водного раствора исследуемого соединения таким образом, чтобы концентрация составляла 100, 10, 1, О, 1, 0,01, 0,001, 0,0001 мг/мл питательной ь

40 среды. Пробирки инкубируются при 37 С.

Через 72 ч определяют прирост клеточного белка в пробирках, в которые добавлялся препарат из контрольных пробирок.

45 Каждую концентрацию исследуют параллельно по двум пробам.

Определяют такие концентрации веще. ства, при которых обеспечивается торможение прироста клеточного бел5о ка на 502, 1.0р,или Еъ

Процент торможения определяют из соотношения остаточного количества клеточного белка по контролю — кон цевое количество белка клеточного в тесте к остаточному количеству клеточного белка по контролю — начальное количество клеточного белка по контролю.

1168557

В соответствии с общепринятыми нормами активными считаются такие соединения для которых 1.П (ED>P

) 55

1 мг/мл.

Предлагаемые соединения тестируются этим методом несколько раз. Например,ЕЭ для одного препарата иэ этой группы с кодовым символом

С-857, т.е. 1-нитро-9-гидроксиэтил- 10 аминоакридина, составляет 0,0007 мг/мл..

Метод in vivo.

Торможение роста мышиной саркомы

Крокера (Sa-180).

Для опытов применяют мышей в воэ- 15 расте около 3 мес, весом около 25 г.

Их прививают срезом опухоли (Ба-180), 50 после чего разделяют на группы: одну контрольную (18 шт.) и две до четырех групп (леченных по 8 шт каждая).

Исследуемые соединения в соответствующих дозах вводят в брюшину после предварительного определения максимальной переносимой дозы (MTD).

В качестве критерия оценки противоопухолевого действия исследуемых соединений применяют процентную разницу между средними весами опухолей контрольных мышей и мышей, получающих препарат, с учетом при . этом токсических эффектов исследуемого соединения. Оценка токсичности охватывает потерю веса леченных животных по сравнению с контролем, 35 число павших животных по сравнению с контролем, а также микроскопические гистопатологические исследования.

Активными считаются такие соединения, которые по крайней мере дваж- 40 ды тормозят рост опухолей более

407, не вызывая при этом падежа животных () 2 шт.) и средних потерь веса ) 4 r.

Исследования in vivo в этом тес- 45 те предлагаемой группы соединений проводят многократно. Так, например, для препарата с кодовым символом

С-857, т.е. 1-иитро-9-гидроксиэтиламиноакридина, установлено торможение роста саркомы Sa-180 в зависимости от следующей дозы: при 0,20,8 мг/кг процент торможения 44-86.

Для препарата С-934, т.е. 1-нитро-9-гидроксибутиламиноакридина, при 55

I дозах 0,2-0,4 процент торможения

45-60.

Фармакологические исследования.

Анализ биологическои активности подтвержден подробными фармакологическими исследованиями.

Проводят исследования токсичности острой и кумулятивной, а также основных фармакологических свойств в следующих тестах: острая токсичность и определение максимальной переносимой дозы, кумулятивная токсичность, влияние на систему кровообращения, на гладкие мышцы, на центральную нервную систему, иммуносупрессивное действие.

Острую токсичность (?.Э ц 7и максимальную переносимую дозу (МТП) определяют на крысах Mister, кроликах (обоего пола) и мышах Albino

Swiss (самки).

Соединения вводят в брюшину (у всех трех видов животных) и желудок (у крыс и кроликов). Продолжительность наблюдения составляет

48 ч.

Полученные значения LD< и MTD сведены в табл. 1.

Таблица 1

Подопытные животные

Пероральное введение, мг/кг

Внутривенное введение, мг/кг

LDso MTD

Мышь 23 4 15

Крыса 9 2 7 5 69 1 30

Кролик 11, 4 7, 5 69, 0 20 нем виде и поведении.

Кумулятивная токсичность. Опыт проводят на нескольких- группах крыс (по 20 шт.), которым исследуемое соединение вводят в течение 14 дней в дозах 1/100 LD>z . Затем животных умерщвляют, после чего производят микроскопическую оценку мышечных органов и брюшной полости.

Исследуемый препарат кумулируется в минимальной степени — смертельность животных, получавших лекарство, по сравнению с контролем составляет около 5Х. Не наблюдаются также потери веса животных и изменения в их внеш1168557

Исследуют подострую токсичность препарата С-857.

Исследование проводят на кроликах, которым в брюшину впрыскивают препарат в дозе 1/ 120 ЕВ

После 21 дня устанавливают незначительное снижение абсолютного веса селезенки и печени, а также рост числа лейкоцитов. Остальные гематологические определения не

° отличаются от определений, выполненных у нормальных животных.

В области гематологических исследований не выявлены изменения в поведении эритроцитной системы, зато наблюдается повышение лейкоцитов.

Остальные химические параметры статистически характерно не отличаются от соответствующих значений у нормальных животных.

В табл. 2 представлен сопоставительный анализ биологических исследований Ледакрина с предлагаемыми производными.

Таблица 2

Цитотоксичная активность

Препарат

Доза, мг/кг

R 7.

М,мм

Тканевая культура (He la и

Не1а ) мг/мл

Процент торможения

Ледакрин (Nitraerine) 78

36 0,006

0,2

0,3

0,6

0,2

С-857

31 О, 006 (Hela)

0,.0007" (Hela ) 92

0,4

0,6

Исследование, касающееся влияния на систему кровобращения и гладкие мышцы, проводят на крысах, которым вводят соединение С-857 в дозах

0,01-20 мг/кг. Препарат не вызывает заметных изменений исследуемых сердечно-сосудистых параметров, т.е. не влияет на артериальное давление на частоту деятельности сердца, не моделирует кривой ЭКГ и не влияет 1О на частоту и амплитуду дыхания. Лишь в самой высокой дозе (20 мг/кг) препарат выявляет слабое спазмолитическое действие на кишку и мочевой пузырь крысы in situ. 15

Препарат не выявляет заметного и направлЕнного действия на центральную нервную систему. В дозах 1/201/2 LD он не выявляет болеутоляющего и антиконвульсивного действий, 20 а также существенного торможения подвижности, но наблюдается незначительное влияние на гексобарбиталовый наркоз.

Препарат лишь после многократного 25 введения в дозе 1/5-1/ 10 LD выявляет иммуносупрессивное действие, проявляющееся в тестах: контактная сенсибилизация пикрилхлориду, местная клеточная реакция типа трансплантат против реципиента, а также множественное воспаление суставов.

При внутрижелудочном введении в дозе 1/20-1/60 LD î в течение

21 дня установлено уменьшение веса печени,не установлены изменения селезеночно-печечного показателя по сравнению с контролем.

Противоопухолевая активность

1168557

Продолжение табл.2 я активность оэа, мг/кг

С-867

24 0,001

0,2

0,4

0,8

С-933

21 0,001

0,2

0,4

0,8

С-934

28 0,005

0,2

0,4

100

0,8

Заказ 4561/23 Тираж 384 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель Н. Бочарова

Редактор Н. Гунько Техред М.Кузьма Корректор О. Тигор