Способ гистохимического выявления аденилатциклазы в нервной ткани

 

СПОСОБ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В НЕРВНОЙ ТКАНИ, включающий ее фиксацию и инкубацию в субстрате, содержащем АТФ, от л ич ающ ийс я тем, что, с целью повьшения точности способа, перед инкубацией т.кань обрабатывают в течение 1,5-2 ч в среде с ингибиторами фосфогидролаз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l 9) (l1) Р)) G 01 N 1/28 А 61 В 10/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (" . 3

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3485150/28-13 (22) 26. 08. 82 (46) 23.07.85. Бюл, У 27 (72) О.В. Копьев и С.А. Ромоданов (71) Киевский научно-исспедовательекий институт нейрохирургии и Киевский государственный институт усовершенствования врачей (53) 613-098,0(088.8) (56) Гайер Г. Электронная гистохимия, М., "Мир", 1974, с. 171-172.

Reik J. Petrold G.Ь., Higgins S.À.

Hormonsensitive adenylcyclase cyto chemical localization im rat liver."Seience", 1970, 168, 382-384. (54) (57) СПОСОБ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО

ВЬИВЛЕНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В НЕРВНОЙ

ТКАНИ, включающий ее фиксацию и инкубацию в субстрате, содержащем АТФ, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности способа, перед инкубацией ткань обрабатывают в течение 1,5-2 ч в среде с ингибиторами фосфогидролаз. 1168819

Изобретение относится к биологии, а именно к гистохимии, и может быть использовано для определения активности аденилатциклазы.

Цель изобретения — повышение точ- 5 ности способа.

При осУществлении способа гистохимического выявления аденилатциклазы в нервной ткани биологический материал подготавливают к электронномикро10 скопическому выявлению аденилатциклазы поэтапно, причем на первом этапе инкубируют в среде без субстрата с ингибиторами фосфогидролаз в течение

1,5-2 ч, а на втором — инкубируют в среде с АТФ в течение 30-40 мин.

Способ подготовки биологического материала к гистохимическому выявлению активности аденилатциклазы с использованием АТФ в качестве субстрата2О осуществляют следующим образом.

Исследуемый материал подвергают префиксации перфузией холодного

iÅ-ного раствора глютаральдегида на

0,1 M фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин. Фосфатному буферу отдают предпочтение перед другими, так как он способствует угнетению активности фосфогидролаз, По этой же причине избран глютаральдегид в качестве фиксатора. Затем материал отмывают на холоде в течение 16-18 ч в 0,1 M трис-малеатном буфере (рН 7,4) с 8Х сахарозы и 1,5-2 ч в 0,1 М трис-малеатном З5 буфере (рН 7,4) с 5 мМ теофиллина, 10 мИ фторида натрия, 10 мМ бубаина, 10 мИ парахлормеркурийбензоата, которые угнетают активность фосфодиэстеI разы, циклического аденозинмонофос- <О фата фосфогидролаз. Указанное вре-. мя отмывки необходимо для максимально полного удаления фиксирующего раствора и частичного восстановления активности аденилатциклазы. Ми- 45 нимальное время инкубации с ингибиторами составляет 1,5-2 ч. Этого времени достаточно для проникновения ингибиторов в наружный слой кусочка ткани и осуществления в нем ÇÎ своего ингибирующего действия. Как известно, гистохимическая реакция циклизации АТФ, катализируемая аде нилатциклазой, проходит именно в этом наружном слое кусочка. 55

После инкубации с ингибиторами материал переносят в среду инкубации следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2; ацетат магния 2; нитрат свинца 2;

АТФ 0,5. Инкубацию проводят 30-40 мин при 37 С, после чего материал обрабатывают по общепринятой электронномикроскопической методике и заливают в эпон-аралдит.

Указанная длительность инкубации (30-40 мин) минимальна и достаточна для появления хорошо идентифицируемого продукта реакции. Более длительная инкубация сопряжена с появлением процессов диффузии, которые затрудняют оценку реакции.

Пример 1. Мозг фиксируют перфузией холодного 17-ного раствора глютаральдегида на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин.

Затем иссекают кусочки мозга около

1 мм в объеме, промывают их 2 ч в 0,1 И трис-малеатном буфере на холоде и инкубируют 30 мин при

37 С в среде следующего состава,мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); ацетат магния 2; ацетат свинца 2;

АТФ 0 5.

Продукт .реакции : в виде обильного грубого преципитата локализован на конденсированном хроматине ядер, плазматических мембранах, эндоплазматическом ретикулуме, что не характерно для аденилатциклазы и характерно для фосфогидролазной активности. На результате реакции не отражается введение в инкубационную среду ингибитора аденилатциклазы аллоксана.

Пример 2. Головной мозг фиксируют перфузией холодного

1Х-ного раствора глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин. Затем иссекают кусочки мозга около 1 мм в объеме, после чего проводят преинкубацию кусочков 1,5 ч на холоде в среде следующего состава: 0,1 М трисмалеатный буфер (рН 7,4) 5 мМ теофиллин, 10 мМ Ьторид натрия, 10 мМ бубаина, 10 мМ парахлормеркурий бензонат. Затем проводят инкубацию

30 мин при 37 С в среде следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (pH 7,4); ацетат магния 2; свинец 2;

АТФ 95.

Продукт реакции локализуется в ви де тонкого преципитата на постсинаптических окончаниях и на плазматических мембранах. Неспецифического

1168819

Составитель В. Чистяков

Техред С.Мигунова

Корректор М. Розман

Редактор О. Бугир

Заказ 4607/36 Тираж 897

ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 отложения продукта реакции не наблюдается. Аллоксаном реакция предотвращается, что свидетельствует о специфичности реакции.

Пример 3. Всю обработку про- 5 водят аналогично примеру 2, но преинкубацию осуществляют 2 ч. Результат такой же, как в примере 2.

Пример 4. Всю обработку про-. водят аналогично примеру 2, но переин-10 кубация длится 2,5 ч.

Количество продукта реакции значительно уменьшено по сравнению с примером.2, кроме того, появилось неспецифическое выпадение продукта реакции,15 не связанное с мембранными структурами °

Пример 5.. Вся обработка аналогична примеру 2, но преинкубацию проводят 1 ч. 20

Распределение продукта реакции характерно для фосфогидволазной активности и не изменяется при введении в инкубационную среду ингибитора аденипатциклазы аллоксана.

Пример 6. Мозг фиксируют и отмывают аналогично примеру 1. Затем без преинкубации с ингибиторами кусочки инкубируют в среде следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2; ацетат магния 1, ацетат свинца 2; аденилилимидодифосфат 0,5.

Продукт реакции в виде тонкого преципитата маркирует активность аденилатциклазы в плазматических мембранах и на постсинаптических окончаниях, но наряду с этим грубый преципитат выявляется на других клеточных структурах и в ударах клеток, что обусловлено гидролизом эндогенного субстрата, активностью фосфогидролаз.