Способ количественного определения @ , @ -метил- @ -(3,4- диоксифенил)-аланина

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕЩШ Ь,о6-метил-/3-

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН ((9) (И) (5()4 G Pl N 21/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н авторскому саиддтельств

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2 1) 3720991/24 — 25 (22) 27.01.84 (46) 23.07.85 ° Бюл. 9 27 (72) Т.Б.Кравченко, С.В. Бельтюкова, Н.С.Полуэктов и Л.И.Кононенко (71) Ордена Ленина и ордена Дружбы народов физико-химический институт

АН Украинской ССР (53) 535.37(088.8) ,(56) 1. 10денфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. М., "Мир", 1965, с. !32-133, 136 †1.

2. Матлина Э.Ш., Киселева З.M ., Софиева И.Э. Методы исследования некоторых гормонов и медиаторов. M.

"Наука", 1965, с. 25 (прототип). (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ь,Ж вЂ” метил-P-(3, 4-ДИОКСИФЕНИЛ)-.аланина, включающий приготовление анализируемой пробы, взаимодействие ее с химическим реагентом и измерение спектра, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа определения, повышения экспрессности, воспроизводимос-и и точности результатов, анализируемую пробу подвергают взаимодействию с раствором хлорида тербия в среде вода — изопропанол в соотношении 1:10 .при рН 8,08,5 в присутствии борогидрида натрия с последующим измерением интенсивности полос спектра сенсибилизированной люминесценции тербия, по которой определяют концентрацию исследуемого вещества.,1168831

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного люминесцентного опре- деления L,eC. — метил- -(3,4-диоксифенил)-аланина (метил-ДОФА). 5

В СССР препарат импортируется из

Венгрии и Югославии под названием

"Допегит" и "Альдомет" соответственно и широко используется как эффективное гипотензивное средство, кото- 10 рое вызывает у больных меньше побочных явлений по сравнению с другими .лекарственными веществами.

В настоящее время в медицинской практике применяется много способов 15 количественного и качественного определения катехоламинов и родственных им соединений — диоксифенилаланина и дофамина.

Известен способ количественного 20 определения диоксифенилаланина, основанный на переведении его во флуоресцирующий триоксииндол. Триоксииндоль- ный метод применяется в различных модификациях, причем всеони включают. 25 стадию отделения с помощью адсорбента, элюацию, обработку окислителем для образования аминохромов, добавление щелочного раствора аскорбиновой кислоты и измерение флуоресценции образовавшегося триоксииндола. Большое число опубликованных модификаций метода говорит о том, что само определение на границах чувствительности метода зависит от многих факторов и от наличия примесей Я . К недостаткам этого способа можно отнести длительность выполнения, возможность наложения спектров люминесценции продуктов окисления адреналина и норад- 4 реналина, что делает результаты анализа плохо воспроизводимыми.

Наиболее близким к изобретению является способ количественного определения метил-ДОФА в порции мочи. Ме45 тод предусматривает предварительное выделение метил- ДОФА на окиси алюминия, элюацию его с колонки. В элюате проводят определение метил — ДОФА.

Окисление с образованием флуоресциру-50 ющих продуктов проводится следующим образом.

Уксуснокислый элюат доводят до рН

4,2 1-2 каплями 1 н аммиака, затем отбирают по 1,0 мл в контрольные „ 55 и опытные пробы, в которые предварительно помещают по 1,0 мл 0,1 M фосфатного буфера с рН 4,2. Затем оставшееся количество элюата доводят до рН 6,2, учитывая количество аммиака, пошедшего на титрование, и во две пробы отбирают количество раствора, соответствующее 1,0 мл элюата. В эти пробы предварительно помещают по

1,0 мл 0,1 M фосфатного буфера с рН 6,2.

Солянокислый элюат также доводят

1 н аммиаком до рН 6,2 в мерных пробирках, затем добавляют воды до

7,0 мл. Из этих растворов отбирают в опытную и контрольную пробы по

1,0 мл и предварительно в эти пробир— ки помещают по 1,0 мл 0,1 И фосфатного буфера с рН 6,2. Три полученные опытные пробы уксуснокислого элюата с рН 6,2 и 4,2 и солянокислого элюата окисляют 0,1 мл 0,25% феррицианида калия в течение 4 мин (контрольные пробы не окисляют) и затем добавляют как .в опытную, так и в контрольные пробы 1,0 мл 0,2 раствора аскорбиновой кислоты, свежеприготовленного в 5 н щелочи. Через 3 мин все пробы доводят, водой до 10 мл, а в контрольные пробы добавляют по 0,1,мл 25 -ного феррицианида. калия. Для большей стабилизации флуоресценции опытные и контрольные пробы охлажда<от на льду в период измерения флуоресценции. Измерение флуоресценции производят на спектрофлуориметре, используя два набора светофильтров (с диапазоном про— пускания от 360 до 600 нм), при двух значениях рН (4,2, 6,2). Путем решения трех уравнений с тремя неизвестными рассчитывают содержание ДОФА и катехоламинов. Путем суммирования со— держания ДОФА в уксусно †кисл и со— ляно †кисл элюатах рассчитывают его общее содержание P) .

К недостаткам метода можно отнести трудоемкость, наличие множества операций, необходимость работы в широкой области спектра (360-600 нм), отсутствие селективности. Спектральные характеристики продукта окисления ДОФА близки к спектральным свойствам адренолютина и норадренолютина, и, следовательно, возможно наложение спектров люминесценции продуктов их окисления. Это обуславливает. плохую воспроизводимость результатов и недостаточную точность.

Цель изобретения — упрощение способа определения метил-ДОФА, повышение экспрессности, воспроизводимости и точности результатов.

1168831

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения L,Ж-метил †-(3,4 †диоксифенил)-аланина включающему приготовление анализируемой пробы, взаимодей- 5 ствие ее с химическим реагентом и измерение спектра, анализируемую пробу подвергают взаимодействию с раствором хлорида тербия в среде вода— изопропанол в соотношении 1:10 при рН 8,0-8,5 в присутствии борогидрида натрия с последующим измерением интенсивности полос спектра сенсибилизированной люминесценции тербия, по которой определяют концентрацию ис- 15 следуемого вещества.

Отличиями в предлагаемом способе по сравнению с известным является взаимодействие анализируемой пробы со стандартным раствором хлорида 20 тербия в присутствии борогидрида натрия при рН 8,0 — 8,5 и регистрация сенсибилизированной люминесценции тербия в его соединении с метил †ДО, обусловленной поглощением света органической частью молекулы и передачей энергии возбужденного состояния ионам тербия, приводит к тому, что снижается предел обнаружения по сравнению с известным, значительно упро- 30 щается анализ и сокращается время его выполнения.

Поскольку в щелочной среде возможно окисление продуктов реакции кислородом воздуха (аналогично тому, как это наблюдается в реакциях с

1,2 — диоксибензол-3,5 †дисульфокислотой), в предлагаемом способе в реакционную смесь добавляется борогидрид натрия. В известном способе в качест-40 ве растворителя используется вода, в предлагаемом — изопропанол. Интенсивность люминесценции тербия в комплексах с метил-ДОФА в изопропанольных растворах на два порядка выше, чем в 45 водных.

Способ определения осуществляется следующим образом.

Ф

К анализируемому раствору добавляют стандартный раствор хлорида тер- 50 бия, создают в растворе щелочную среду (рН 8,0-8,5) с помощью борогидрида натрия, регистрируют интенсивность люминесценции тербия при 9 =546 нм.

Содержание метил-ДОФА в пробе опреде- 55 ляют либо по калибровочному графику, либо по методу добавок. Наименьшее обнаруживаемое количество метил-ДОФА0,00 1 мкг/мл. При определении метилДОФА в биологических жидкостях и тканях, отделение его от катехоламинов осуществляется хроматографическим способом.

Пример. Количественное определение метил-ДОФА в лекарственном препарате "Допегит". Одну таблетку препарата "Допегит" тщательно измельчают, растворяют в дистиллированной воде при подкислении соляной кислотой до рН 4,0-5,0, раствор переносят в мерную колбу на 250 мл. Раствор отфильтровывают и в фильграте определяют содержание метил-ДОФЛ.

Для получения стандартного раствора хлорида тербия (1 мг/мл) точную навеску оксида тербия растворяют в соляной кислоте, выпаривают до получения влажных солей и разбавляют дистиллированной водой.

В пробирку помещают 0,1 мл исследуемого раствора с содержанием метилДОФЛ 0,1-0,01 мкг/мл, приливают

0,2 мл стандартного раствора хлорида тербия (содержащего 1 мг/мл TbC1 ), добавляют 0,7 мл дистиллированной воды и 9 мл изопропанола, после этс— го добавляют 1 мг борогидрида натрия для создания необходимого рН раствора и предотвращения окисления растворов комплексов.

Спектры люминесценции регистрируют с помощью спектрографа ИСП-51 с

ФЗП-1 (либо другого спектрофлуориметра) при h,ö =546 нм. Люминесценции возбуждают ртутно-кварцевой лампой

СВД-120Л со сфетофильтром УФС-2. Растворы комплексов устойчивы во времени и сохраняют люминесцентные свойства в течение получаса. Содержание метилДОФА определяют по калибровочному графику, а также по методу добавок, учитывая величину пиков люминесценции пробы и пробы с добавками.

При малых содержаниях метил-ДОФА в пробе необходимо регистрировать интенсивность люминесценции холостого опыта и вычитать ее из интенсивности люминесценции пробы. Точность и достоверность способа были проверены в лабораторных условиях путем статической обработки результатов анализа препарата Допегит". Результаты определения метил-ДОФА в препарате "До-. пегит" (п=10, „=2,28) представлены в таблице.

1168831

Введе мкг

0,001 0,00098

0,005 О,00496

О, 001 «+О, 000039 4, О

О, 005+ О, 000159 3, 2

0,01520,000417 3,6

0,015 0,01508

0,050 0,00051 1,42

О, 080+ О, 00075 1, 26

0,600+0,00068 1,43

0 050 0,04970

0,080 0,0798

0 600 O,б030

Составитель Н.Зоров

Редактор А.Шандор Техред Л.Микеш

Корректор А.Обручав

Заказ 4608/37 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4

О, 030 О, 0296 О, 030> О, 00040 1, 35

Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с прототипом: сокращается время проведения анализа и упрощение его за счет исключения множества операций, необходимых для переведения метил-ДОФА в флуоресцирующие оксииндолы; измерение

10 ийтенсивности люминесценции проводится в видимой области спектра при одной длине волны, повышение точности и воспроизводимости определения за (счет исключения наложения спектров люминесценции продуктов окисления других катехоламинов.