Способ получения плазминогена

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА , включающий дбработку животного сырья хлоридом натрия в фосфатном буфере, аффинную хроматографию, элюцию хлоридом натрия в фосфатном буфере, затем аминокапроновой кислотой с последующим вьщелениём целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве сырья используют отходы получения церулоплазмина, а полученный элюат подвергают гель-фильтрации на молселекте и лиофилизируют.

СОЮЗ С08ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

)19) ®<())) 47 (51) 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТЭЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3681567/28-14 (22) 18.! 1. 83 (46) 30. 10.85. Бюл. № 40 (7!) Институт биохимии им. А.В.Палладина и Киевское предприятие по производству бактерийных препаратов (72) С.А.Кудинов, Ю.В.Волощенко, И.П.Галич, И.Н.Гавриш, С.В.Лопато и С.Н.Дробаха (53) 664.932.4(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1069222, кл. А 61 К 37/47, 1980. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗИИНОГЕНА, включающий обработку животного сырья хлоридом натрия в фосфатном буфере, аффинную хроматографию, элюцию хлоридом натрия в фосфатном буфере, затем аминокапроновой кислотой с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве сырья используют отходы получения церулоплазмина, а полученный элюат подвергают гель-фильтрации на молселекте G=25 и лиофилизируют.

826

l 1187

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается технологии получения ферментных препара-, тов.

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. К 5 л жидкости, являющейся отходом после выделения 10 церулоплазмина, прибавляют сухой

NaC1 до концентрации 0,14 М, доводят рН жидкости до 7,4 с помощью

0,5 M фосфатного буфера с рН 7,4.

Далее выделение плазминогена ведут 15 на аффинном сорбенте. Добавляют

60 r L-лизин-сополимера малеинового: ангидрида с N-винилпирролидоном, тщательно перемешивают в течение

14 ч при (-4) -(-7) С для сорбции 20 плазминогена. Затем прекращают .перемешивание. После отстаивания суспензии в течение 30 мин надосадочную жидкость декантируют и удаляют, Проводят песпецифическую 25 элюцию балластных белков 3-4-кратным объемом 0,5 M раствора NaC1 в О 01 М фосфатном буфере, рН 7,4 при +18-25 С. Эту операцию повторяют несколько раз до тех пор, пока Egg> промывных вод становится ниже О, 1. Затем осуществляют специфическую элюцию плазминогена; аффинный сорбент с сорбированным плазминогеном наносят на воронку

Бюхнера, прибавляют 2-3-кратное количество охлажденного до 4 С элюента 0,2 М раствора Е-аминокапроновой кислоты в 0,05 M фосфатном буфере рН 7,3,перемешиваютв течение3-4 мин 4б жидкость отсасывают с помощью водоструйного насоса. Операцию повторяют до тех пор, пока Е получаемого элюата становится не выше 0,150.

Объем элюата 1-1,5 л. Полученный элюат,содержащий плазминоген,подвергают обессоливанию путем гель-фильтрации на колонках из молселекта

G-25> которые предварительно эквилибрируют дистиллированнойводой,подкис- >р ленной уксусной кислотой до рН 4,0 (параметры колонки: внутренний диа" метр 8 см; высота 50 см; объем 2,0 л).

После гель-фильтрации раствор плазминогена, освобожденный от солей и -аминокапроновой кислоты, подвергают лиофильному высушиванию в следующем режиме: замораживание проводят при

-50 С, высушивание в сублимационной камере ТГ-15 в течение 80 ч при подогреве не выше 35 С. Режим лиофилизации соответствует требованиям Типового регламента производства губки гемостатической, 1972 r. Выход плазминогена — 904 мг.

Пример 2. Способ получения плазминогена до этапа лиофилизации проводят согласно схеме, указанной в примере 1. Раствор плазминогена после гель-фильтрации подвергают лиофильной сушке в следующем режиме: о замораживание проводят при -40 С, высушивание — в сублимационной камере ТГ-15 в течение 45 ч при подогрео ве не более 38 С. Режим лиофилизации соответствует требованиям Регламента производства фибринолизина, 1978 г.

Выход плазминогена — 1102 мг.

Пример 3. Способ получения плазминогена до этапа лиофилизации проводят согласно схеме, указанной в примере 1. Раствор плазминогена после гель-фильтрации лиофильно высушивают в следующем режиме: заморажио ванне проводят при -40 С, высушивание — в сублимационной камере ТГ-15 в течение 18 ч при подогреве не более 22 С. Режим лиофилизации соответо ствует требованиям Регламента производства иммуноглобулина человека нормального, N- 131-79. Выход — 808 мг.

Содержание белка в препаратах плазминогена определяли спектрофото-" метрически в 1 см кювете, принимая, что Е д 1Х-ного раствора плазминогена =17 или 16 для растворов белка в кислой среде. Потенциальную активность плазминогена в лиофилизированных препаратах определяли, используя в качестве субстрата 1Х-ный раствор казеина; в качестве активатора плазминогена использовали раствор стрептокиназы (препарат "Streptase" фирмы Behringwerke Ag), содержащий

750000 Е/фл, За t казеинолитическую единицу принимали такое количество фермента (плазмина, образовавшегося из плазминогена), которое освобождает 450 мкМ растворимого в 15Х-ной трихлоруксусной кислоте тирозина в условиях анализа..

Влагу в препаратах плазминогена определяли при 105 С (см. Регламент производства фибролизина, 1978 г).

SDS-электрофорез лиофилизированных препаратов плазминогена проводили

Составитель В.Брусиловская

Редактор С.Лисина Техред М.Кузьма Корректор Е.Рошко

Заказ 6575/5 Тираж 721 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, -35 Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 в полиакриламидном теле в системе трис-бортаного буфера при рН 7,4.

1187826 4

На анализ брали растворы илазминогена. содержащие 25-50 у" белка..