Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем

 

1. Способ получения ферментног го фотографического материала, включающий обработку полимерной подлоз Г ки раствором фермента, о т л и - чающийся тем, что, с целью удешевления фотоматериала, повышения его светочувствительности и качества изображения, подложку предварительно обрабатывают раствором азида , а фермент используют в активной форме, не содержащей высокомолекулярных агрегатов.. 2. Способ получения изображения на ферментном фотографическом мате-. риале, включающий его экспонирование ультрафиолетовым светом, прояв- . ление и закрепление в водных ворах, отличающийся тем, что, с целью повьшения качества изображения , закрепляют перед проявлением в растворе, содержащем дополгнительно детергент, а проявляют в растворе, содержащем дополнительно реагенты гистохимической визуализации фермента. СО 00 i4i

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН,А уц4 0 03 С 1/72

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«"- »

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3729750/24-10 (22) 20.04.84 (46) 15.11.85. Бюл. Р 42 (71) Новосибирский институт органической химии СО АН СССР и МГУ им. M.В. Ломоносова (72) И.В. Березин, N.À. Грачев, М.И. Добриков, Н.Ф. Казанская, К.Мартинек (С$), А.А. Мустаев и Г.В. 1цишкин (53) 773.79(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 439780, кл. G 03 С 1/72, 1974.

Авторское свидетельство СССР .

У 595693, кл. G 03 С 1/40, 1978. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО

ФОТОГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ НА НЕМ. (57) 1. Способ получения ферментно; го фотографического материала, включающий обработку полимерной подлож,„„SU„„1191874 ки раствором фермента, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью удешевления фотоматериала, повышения его светочувствительности и качества изображения, подложку предварительно обрабатывают раствором азида, а фермент используют в активной форме, не содержащей высокомолекулярных агрегатов.

2. Способ получения изображения на ферментном фотографическом материале, включающий его экспонирование ультрафиолетовым светом, прояв-, ление и закрепление в водных растворах, отличающийся тем, что, с целью повышения качества изображения, закрепляют перед проявле» нием в растворе, содержащем допол." нительно детергент, а проявляют в

° растворе, содержащем дополнительно

peareHTbI гистохимической визуапизации фермента.

1191874

Изобретение относится к бессереб-, ряной фотографии, точнее к фотоматериалам для получения полутоновых черно-белых и окрашенных изображеHHA 5

Цель изобретения — удешевление фотоматериала, повышение его светочувствительности и качества изображения.

Способ получения ферментного фотографического материала осуществляется следующим образом.

Приготавливают полимерный.листовой материал, несущий светочувствительные реакционноспособные группы. 15

Для этого полимерную подложку, например целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, фосфоцеллюлозу, желатину или карбоксиметилсефадекс, модифицируют бифункциональными фотореаген- 20 тами с помощью реакций алкилирования или ацилирования. В качестве би« функциональных фотореагентов используют(ароматические азиды, содержашие я-хлорэтиламиногруппы, карбоксильные амико- и другие реакционноспособные группы, модифицирующие полимерную подложку.

Наносят на подложку раствор активного фермента, например щелочной 30 фосфотазы, лактатдегидрогенаэы, пер.оксидазы, субтилизина, Ы-химотрипси на и др. (предварительно раствор фермента фильтруют через полимерный носитель для удаления сильно сорбирующихся агрегатов )и высушивают.

Способ получения изображения; на полученном, как описано, выше фотоматериале осуществляется следующим образом. 40

Фотоматериал экспонируют через галогеносеребряный полутоновый негатив или через трафарет с помощью ртутных ламп ДРШ--500 или БУФ-15. В результате фотораэложения ароматичес- 4g ких азидов с образованием высокореакционноспособных нитренов в экспонированных участках фермент ковалентно и неспецифично, т.е. не по активному центру, присоединяется к поли- g0 мерной матрице беэ заметного уменьшения своей каталитической активности.

Закрепляют скрытое изображение вымыванием несвязанного фермента, у например обрабатывают буферным раствором с большой ионной силой, содержащим поверхностно-активные вещества, например 0,1 M НС1, 1 И HaCl и "Тритон Х-100". В результате ковалентло не связанный фермент переходит в раствор и на подложке образуется стабильное скрытое изображение, состоящее из фотоиммобилизованного фермента.

Проявляют скрытое изображение методами гистохимической визуализации ферментов, т.е. обрабатыва;от водными растворами хромогенных . субстратов, специфичных для данного фермента, например Ы-нафтилфосфат для фосфотазы, Н О с о-дианизидином для пероксидазы, индоксилбутират для субтилизина и др, В результате ферментативных реакций в местонахождении последнего происходит накопление красителя, что и приводит к образованию видимого изображения.

Предлагаемый способ применим к ферментам практически всех классов, поскольку в указанных условиях к подложке ковалентно присоединяются любые белки, находящиеся на полимерном носителе. Это определяется способностью ароматических аэидов при облучении УФ-светом давать высокореакционноспособные частицы — нитрены, способные модифицировать практически все типы химических связей, причем квантовый выход фотолиза ароматических азидов в полосе поглощения близок к единице. Выбор подложек с ковалентно присоединенными азидогруппами весьма широк.

Многообразие методов гистохимической визуализации каталитически активных ферментов позволяет получать изображение любого цвета, в том числе и черно-белое. Другими достоинствами предлагаемых способов яв-. ляются легкость получения полутонового изображения и возможность ис- пользования ферментативных препара-. тов низкой степени очистки, что . значительно снижает стоимость фотоматериала.

Изобретение иллюстрируется примерами с ферментами классов гидролаз и оксидоредуктаз. Во всех примерах, если это специально не оговорено в тексте, растворитель — вода, температура комнатная (20-25 С).

Пример 1. а) Получение светочувствительного полимерного материала.! 1918-74

10

50 ферментативной реакции с солями ди-, азония при комнатной температуре

0,1-1 ч в растворе, содержащем: с(;Нафтилфосфат натрия, мг 5

Диазоль синий

2 С, мг

1 мИ трис: HCI, 1 М NaCI, I мИ

MgCl2, 10 о М

ZnCI, рН 9,6, мл 10

После проявления получают чернобелое изображение, которое многократ- но промывают водой и сушат.

Пример 3. а) Получение полимерного светочувствительного материала.

Светочувствительную карбоксиметилцеллюлозу получают, как в примере 2 а. б) Нанесение фермента на светочувствительный материал.

10 мг пероксидазы из хрена ("Reanal", BHP) с активностью 400 ед./мг растворяют в 100 мл 0,,1 M ацетата натрия, рН 5,0, и фильтруют через карбоксиметилцеллюлозу. Светочувст-, вительный носитель погружают на

1-3 с в раствор фермента и промакают фильтровальной бумагой. в) Получение скрытого изображения.

Фотоматериал экспонируют, как в. примере 1 в °

r) Закрепление изображения.

Экспонированный образец отмывают от несвязанного фермента при 2037 С дважды по 15 мин раствором 1 о

40 примера 1, затем 15 мин 0,1 M KNO»

0,1 М раствором ацетата натрия, рН

5 О. д) Проявление.

Закрепленное скрытое изображение

45 из фотоиммобилизованной пероксидазы проявляют при комнатной температуре 0,5-1 ч в растворе, содержащем цд °

0,01 М о-дианизидин в этаноле 1

0,1 М ацетат натрия, 1 мИ СаС1, . рН 5,0 10

ЗХ-ная перекись водорода 0,5

Получают темно-коричневое изображение на белом фоне, которое Д4 раза по 2-3 мин промывают водой и сушат.

Пример 4. а) Получение полимерного светочувствительного материала.

Задубленный желатиновый слой фотопластинки с отмытым галогенидом серебра смачивают раствором Ы-метил-N-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гидрохлорида в абсолютном метаноле ,(50 мг/мл) из расчета 0,1 мл/см и термостатируют 12 ч при комнатной температуре. Алкилированный желатн новый слой последовательно промывают в течение I ч I М ИаС1, 3-4 раза по 2-3 мин водой и сушат на воздухе.

Нанесение фермента, получение скрытого изображения, закрепление его и проявление проводят, как в примере 2 б, в, г, д.

Пример 5. а) Получение полимерного светочувствительного материала.

Лист хроматографической бумаги

ФН-11 (8х40 см) помещают в колбу

1 на 500 мл и приливают раствор и-нитробензоилхлорида (Il г) в 450 мл пиридина. Реакционную смесь нагревают о до 80 С и выдерживают при этой температуре 6 ч. После этого пиридиновый раствор сливают, а бензоилированную целлюлозу трижды промывают разбавленным раствором Н SO, 3-4 ра за по 2-3 мин водой, вымачивают 1 ч в О,OI M Na, опять промывают водой, затем ацетоном и сушат на воздухе. Восстанавливают и-нитробензойный эфир целлюлозы 15 .мин при 60 С в растворе, содержащем 500 мл 5Хного раствора сегнетовой соли в воде: 10 мл 15Х-ного раствора TiCI . и-Аминобензойный эфир целлюлозы 34 раза по 2-3 мин промывают водой, этанолом и сушат на воздухе. Диазотирование материала проводят при о

0,2 С в течение 0,5 ч в .растворе

3 г NANO> в 100 мл, 0,01 М HCI. Эту и последующие операции проводят в затененном месте, После этого бумагу промывают ледяной водой и помещают в раствор 2,5 r БаН в 0,01 М HCI на 0,5 ч при 0-5 С. Светочувствительный и-аэидобензойный эфир целлюлозы

3-4 раза по 2-3 мин промывают водой, затем ацетоном и сушат °

Нанесение фермента, получение скрытого негативного изображения, з 119!874

Лист фосфоцеллюлозы (Watman P 81)

B (Й!1 .)-форме промывают трижды в 1 М растворе НаС! по 15 мин, затем 34 раза водой по 2-3 мин и сушат на воздухе. Полученйую натриевую соль фосфоцеллюлозы помещают в плоскодонную прямоугольную кювету, наносят раствор N-метил-N-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гидрохлорида в абсолютном метаноле (30 мг/мл) из расчета !О

0,1 мл/см . Эту и последующие операции проводят в затененном месте или при красном свете. Кювету термостатируют в течение 3 ч.при 50 С. Модифицированную фосфоцеллюлозу после- !5 довательно отмывают в 1 М NaCI 1 ч, 3-4 раза водой по 2-3 мин, 1 ч этанолом, ацетоном и.сушат.

6) Нанесение фермента на светочувствительную подложку. 20

Суспензию лактатдегидрогеназы из мышц свиньи ("Reanal", ВЙР), концентрация IO мг/мл, активность 2 ед/

/мг, в 3 M (И11 <) 2804, разбавляют в

10 раз 1 М раствором трис: НС!, рН 25

8,0. Полученный раствор фильтруют через фосфоцеллюлозу. Светочувствительный материал погружают на 1-3 с 1 в фильтрованный раствор фермента и промакают фипьтровальной бумагой. в) Получение скрытого негативного иэображения.

Полученный фотоматериал экспонируют через негатив полным спектром

ДРШ-500 0,2-4 мин с расстояния 15 см

35 нли тремя лампами БУФ-15 в течение

10-20 с через трафарет с расстояния P

40 см. и г) Закрепление проводится при л

20-37 С дважды по 15 мин раствором 40

0,1 И трис: HCI, I M NaCI, 1 мМ и

MgCI, 10 ZnC12, 5 г/л "Тритон-Х

100", рН 8,5 (раствор 1), затем

15 мин раствором 1 М фосфата натрия, н рН 7,5.

45 д) Проявление.

55 рия, мл

Отмытое от несвязанного фермента скрытое изображение проявляют при

37 С в течение 0,5-1 ч в растворе, содержащем:

Никотинадениндинуклеотид, мг 20

Феназинметасульфат, мг 2

1 M лактат натНитротетразолиевый синий, мг 30

0,1 М фосфат натрия, рН 7,4, IOO

После проявления получают фиолетовое изображение на белом фоне, которое 3-4 раза по 2-3 мин промывают водой и сушат.

Пример 2. а) Получение светочувствительного полимерного материала.

Лист карбоксиметилцеллюлозы (Matman CM 82) в (Н+3 -форме на 15 мин погружают в 0,01 И раствор NaOH вы держивают 1 ч в I М NaCI и сушат при комнатной температуре. Полученную натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы в кювете смачивают раствором ал- килирующего фотореагента Б-метил-И-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гид- рохлорида в абсолютном метаноле (30 мг/мл) из расчета 0,1 мп/см . Эту и последующие операции проводят в затененном месте. Кювету термостати о руют 3 ч при 50 С. Далее промывают ч в 1 М NaCI 3-4 раза по 2-3 мин в воде, ч в этаноле, ацетоне и су шат. б) Нанесение фермента на свето- " чувствительный материал.

50 мг щелочной фосфотазы из кишок цыплят ("Беапа1", BHP) с активностью 0,4 ед/мг растворяют в 100 мл . раствора 1 мМ трис: НСI, I М NaCI

Н 8,2, добавляют 10 г (NH 4)2SO+ фильтруют через карбоксиметйлцелюлозу. Модифицированную подложку на

-3 с погружают в раствор фермента промакают фильтровальной бумагой. в) Получение скрытого изображения.

Приготовленный фотоматериал экспоируют через негатив лампой ДРШ-500 течение 1-4 мин с расстояния 15 см или тремя лампами БУФ-15 в течение

15-20 с через трафарет с расстояния

40 см. г) Закрепление изображения проводят при 20-37 С дважды по 15 мин раствором 1 примера l,затем 15 мин раствором l мМ трис: НСI, 1 М NaCI, 1 мМ MgCI> 10 ZnCI2 ° pH д) Проявление.

Закрепленное скрытое изображение из фотоиммобилизованной щелочной фосфотазы проявляют методом одновременного азосочетания продуктов

I 191874

0,25 I 30

0,10 1,35

0,10 0,80

0,20 1,40

0,13

0,010

0,01

1,ОО

0,03 0,00015

0,02

0,10

1,10

0,10

0,005

1,10 закрепление его и проявление проводят, как в примере 2 б, в, r, д.

Пример 6. а) Получение полимерного светочувствительного материала. и-Азидобензойный эфир целлюлозы получают, как в примере 5 а.

Нанесение фермента, получение скрытого изображения, закрепление его и проявление проводят, как в примере 1 б, в, г, д.

Пример 7. а) Получение полимерного светочувствительного материала. и-Аэидобензойный эфир целлюлозы получают, как в примере 5 а.

6) Нанесение фермента на светочувствительный материал.

20 мг субтилизина из Bacilus subtilis с активностью !2 ед./мг растворяют в 100 мл 0,05 М CaCI» 0,1 M трис: HCI, рН 7,0. Раствор фермен-, та фильтруют через карбоксиметилцеллюлозу и пропитывают им носитель.

Фотоиммобилизацию фермента и отмывку несвязавшегося фермента проводят, как в примере 2 в, г. д) Проявление.

Закрепленное скрытое иэображение из фотоиммобилизованного субтилизина проявляют в течение 0,5-1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 0,1 M KCI; 0,05 М

CaCI>, 0,l М трис: НСI, 157.-ный метанол, рН 7,8; О,l мМ индоксилбутират. После проявления получают голубое изображение на белом фоне, ко-.. торое 3-4 раза по 2-3 мнн промывают водой и сушат.

Пример 8. а) Получение полимерного светочувствительного материала.

0,5 r CM-сефадекса С-50 в 50 мл дистиллированной воды в присутствии

0,05 г реактива Вудворда инкубируют

1 ч на качалке, затем добавляют 0 1 r и-фенилендиамина и инкубируют в течение 3 ч при 20 С. Носитель промыва" !

0 ют на стеклянном .фильтре попеременно водой и 1 М ЯаС! до обесцвечивания промывной воды. К полученной подложке добавляют 0,5 мл концентрированной HCI в 50 мл воды и медленно

15 перемешивают в течение 0,5 ч. При

О-5 С добавляют раствор 0,2 r 11аМО в 1 мл Н О. Через 0,5 ч избыток азо- . тистой кислоты разрушают мочевиной. и приливают раствор 0,2 r Май в 1 мл

20 H О. Реакционную смесь перемешивают еще 0,5 ч. Модифицированный СИ-сефадекс 3-4 раза по 2-3 мин промывают водой в затененном месте и сушат на воздухе. Сухой светочувствительный д гель наносят на клейкую поверхность.

6 ) Нанесение фермента на светочувствительный материал.

20 мг о -химотрипсина быка с активностью 7,5 ед./мг растворяют в

30 100 1 М HCI и фильтруют через карбоксиметилцеллюлоэу, светочувствительный гель пропитывают раствором фермента из расчета 200 мг фермента на 1 г геля.

Фотоиммобилизацию фермента,закрепление скрытого изображения и его проявление проводят, как в примере 7 в, r, д.

Сенситометрические характеристи40 ки фотоматериалов, полученных и отобранных в соответствии с примерами 1-8, приведены в таблице.

Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к светочувтствительным композициям для голографии и может быть использовано в химико-фотографической промышленности

Изобретение относится к фторполимеризующимся композициям для сухих пленочных фоторезистов водно-щелочного проявления, находящих применение для получения рисунка при изготовлении печатных плат в радиоэлектронной промышленности
Изобретение относится к фоточувствительным материалам на основе оксидов цинка и/или титана в связующем
Изобретение относится к термопроявляемым фотографическим материалам на основе водопроницаемых полимеров с добавками солей металлов и может быть использовано в системах записи оптической информации

Изобретение относится к радиационно-чувствительной фоторезистной композиции

Изобретение относится к способам получения фоточувствительных слоев сульфида свинца, которые применяют при изготовлении полупроводниковых приборов, чувствительных к инфракрасному излучению
Изобретение относится к фоторефрактивному полимерному материалу с высокой дифракционной эффективностью в ближней инфракрасной области электромагнитного спектра и может быть использовано в оптоэлектронных устройствах, в процессах записи динамических голограмм в реальном масштабе времени и других фотонных технологиях

Изобретение относится к составу для светочувствительного слоя фотоматериалов, которые могут быть использованы в системах записи информации, для получения изображения в фотографии и полиграфии

Изобретение относится к области изготовления пленочного фоторезиста и сеткотрафаретных экранов на его основе, используемых в производстве печатных плат, керамических корпусов интегральных схем, изделий полиграфической промышленности
Изобретение относится к нанотехнологии и направлено на создание нанокомпозиционных материалов с эффективно управляемыми оптическими свойствами, которые могут быть использованы в нелинейной оптике, информационной технике, при разработке средств оптической памяти и т.д

Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем

Наверх