Способ очистки трипсина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ . РЕСПУБЛИН

<Ю И!1

Ш4 A 61 К 35/39

229 A

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, 18

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3687009/28-14 (22) 06.01.84 (46) 07.02.86. Бюл, Н 5 (71) Институт биохимии им.A.Â.Ïàëëàдина, Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хоэяйст8 и.,океанографии и Институт физической химии им.Л.В.Пнсаржевского (72) Т.Н.Пивненко, М.В.Колодзейская, С.А.Кудинов, А.П.Мелешевич, Л.Б.Маленьких, И.П.Федорова, . В.H.Àêóëèê и Л.М.Зпштейн (53) 615.362.342.4 (088.8) (56) Core ton С . В,E ndopep tl blase s of

Salmon leca, Cromatographl c Separatl on aM Some propeг tlеа Аrch,в,B.

1965, ч.112, р.218-223. (54)(57) СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРИПСИНА, включающий получение экстракта пилорических придатков рыб и последующее его хроматографирование, отличающийся тем, что, с целью повьппения чистоты целевого продукта и упрощение способа, хроматографирование проводят с использованием в качестве сорбента 1,6диаминогексанполимер бумаги, прн этом сорбцию осуществляют буферной смесью 0,05-0,07 М трис-НС1, содержащей 0,05-0,1 М NaCl, при рН 7,88,0, промывку проводят последовательно указанной смесью и 0,030,05 М раствором глицина при рН 10,3 — 10,6, а десорбцню проводят 0,05-0,2 М раствором лизина прн рН 10,4-10,6, 1209

Изобретение относится к технологии очистки ферментных препаратов из животного сырья, н частности трипсина °

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта и упрощение способа.

П р и и е р. Нанеску цилорических придатков лососеньгх размельчают, затем гомогениэируют дважды на микро- IO иэмельчителе тканей РТ-2 со скоростью 5 Гыс об /MHH po пол«уч ния однородной массы при +4 С. K гомогенату прибавляют три обьема окпажденной дистиллированной нодь«:, содер- 15 жащей 0,001 М CACI„,. пере|гешнвают и оставляют на холоде на 2 ч, Центрифугируют материю., на ц»-.нгрнфу» е К-23 со скорастьк гыс.об/»

/мпн при + 2 С. Содержание бенк» оп- И ределяют по методу Лоури.

Колонку размером IХ10 см, .ап няют сорбентом I,б-диаминс;г;:;.-.а- .полимер-бумага которьй ;с-";. .ня. следующим образом.

Б качестве носите»« « ;, o»;ьэуг:„ привитый сополимер целлюлоза-полиглицниил-метакрила т. Исг»и па нег,,ьа ;-: мономер глицидилметакрилата содержит ъг»оксидную групп«г . у»-" .", „: знк«», .,;-; 16 номеp легко впитывается В б«маг, « котбрую обл yчают после преднаpи ".."ль" ной пропитки мбномеро;= . на уст: ка-ке ЖбР-2 (Со 1 . Для . ропит.ки хро ».. ьо « то "рафическую бумагу погружаю.г э глицидилметакрилат на 2-3 мин пр" комнатной температуре. Избыток моно-мера удаляют отжимом. Образцы помеща ют н емкость,;свободную от кислороИ да. Затеи облучают их g --лу-.ами Со,»»1 при мощности 1000000 рад/»" дозой

4 мрад при комнатной гемпературе, После облучения получаемьн» модифицированный материал дополнительно обрабать»нают для удаления непрореагированшего мономера.

Для определения количе"тва привитого полимера облученный образец обрабать»нают кипящим ацетоном для удаления не вошедшего в реакцию мономера. При дозе 4 мрад количестso ГМА составляет 70% от веса бумаги. Конверсия мономера при этом

100%.

Далее. полученный носитель обраба- 55 ть»вают гексаметилендиамином. Содержание аминогрупп определяют обрат- ным титрованием. Заливают навеску

229 2 бумаги 0,1 и HCI и через 4 ч сттитровывают остаток непрореагиронанmeA НСI 0,1 и раствором Na0H по метилоранжу. Затем рассчитывают аминное число и % содержания аминогрупп. Их содержание аминогрупп составляет 1,2-1,4%.

Хроматографирование экстракта осуществляют следующим образом.

На колонку, заполненную сорбентом и уравновешенную 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,8, насос 40 мг экстракта н этом же буфере, Эстеразная активность исходного элюента: 1020 ед/кг белка субстрат трипсина — ТАМЭ вЂ” тозил

Ь-аргинин метилоньгй эфир, 18?0 ед/мг белка (субстрат химотрипсина-БТМЭбенэоил-1, -тирозин метиловый эфир}.

Затем проводят промывание колонки сначала 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,8, содержащим 0,05 M МаС1,, для удаления пигментов, баластнь»х белков, а -.;àòåè 0,03 M раствором глицина при рН 10 3 для удаления неспецнфически :.вязанных с сорбентом трипсина и химотрипсина, после чего проводят десорбцию целевого продукта 0„05 М раствором лизина при рН 10„4 и сразу доводят рН полученной. фракции дс в личины 7,8 с помощью 0,001 М HCI.

Скорое".ь протекания ураннонеши:;-ающ.".-гася-буфера и элюирующего раст,«,.ра ереэ колонку 24 мл/ч.

Полученный компонент содержит чистый трипсин, гомогенный н ПААГ.

Вьгход по общей активности от сорбированного препарата 29%, удельная активность по ТАМЭ 4086 ед/мг белка, "..е, в 4 раза вьппе, чем в исходном материале, химотрипсиновая активность (.субстрат БТМЭ) отсутстнует н конечйом продукте.

Определение эстеразной активности проводят по методу Шнерта и

TBKенаки °

К 3 мл 0,0005 М субстрата (Т)ИЭ или БТМЭ) прибавляют 0,2 мл ферментиого раствора, содержащего от 20 до 50 мкг белка. Измеряют зкстинкцию поглощения на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 253 нм пробы (инкубация 10 мин ) против контроля 1эта же смесь, Т 0 мин). Реакцию проводят при 25

Расчет удельной активности фермента проводят по формуле

1209229

Составитель 3.Цыганов

Техред Ч.Пароцай Корректор А.Тяско

Редактор A. Âîðîâè÷

Заказ 340/1О Тиразк 659 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.уагород, ул. Проектная, 4

Е

A 33 5 х 0,001 х а где Š— разница между. значениями зкстинкций, измеренных при длине волны 253 нм в момент . начала и окончания реакции;

5 — время реакции, мин; а — количество белка в исследуемой пробе, мг.