Способ определения фибринолитической активности

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) С 12 q 1/70 (2 1) 37 33840/28-1 4 (22) 03.05.84 (46) 15.02.86. Бюл. Ф 6 (71) ИГУ им.М.В.Ломоносова (72) Н.С.Егоров, В.А.Иваница, М.А.Аль-Нури и А.Ю.Кривова (53) 612. 115(088.8) (56) Егоров Н.С., Аль-Нури И,А., Кривцова А.Ю. Оптимизация питательной среды для Actinomyces sphегоides— продуцента протеолитических ферментов с фибринолитическим действием. -Микробиология, 1976, 45, 4, с. 607.

„.SUÄÄ 211292 . А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ, включающий суспензирование фибрина в НС1-трис буфере и смешивание с фибринолитической фракцией, инкубацию с последующим спектрофотометрированием, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности, предварительно очищенный фибрин суспензируют при рН 7,8-8,0, смешивают с фибринолитической фракцией в соотношении

40: 1-20: 1, инкубируют в течение

20-40 мин и фильтруют. мкг ти озина

=27 6 — — — " — — —.— мг белка мин

В реакционную смесь вносят 50 мкг активного белка. Инкубацию проводят при 36 С 20 мин.

Калибровочную кривую строят по тирозину. Для построения калибровочной кривой в ряд пробирок вносят

20-200 мкг тирозина, растворенного в 0,01 M трис-НС1 буфере рН 7,8 и доводят объем до 2,0 мл. В полученС ных растворах содержание аминокислоты соответствует 10-100 мкг тирозина в 1 мл буфера. Оптическую плотность раствора измеряют спектрофотометрически против контроля при длине волны 280 н,м. Контролем служит

0,01 M трис-НС1 буфер рН 7,8. По полученным результатам строят калибровочную кривую, откладывая на .оси абсцисс количество аминокислоты в мкг/мл, а на оси ординат показатели спектрофотометра.

3 1211292

Изобретение относится к способам определения биологической активности и может быть применено в медицинской, микробиологической и пищевой промышленностях. 5

Целью изобретения является повышение точности и экономичности способа определения фибринолитической активности.

Пример 1. 100 г коммерчес- 10 кого фибрина (Олайне, Литовская ССР, завод химических реактивов) суспензируют в 3 л дистиллированной воды рН 5,0 24 ч. Центрифугируют и промывают водой до тех пор, пока про- 15 мывные воды не будут давать реакцию с нингидрином. Далее центрифугируют и осаждают фибрин 4 объемами охлажо денного до (-10)-(-15) С ацетоном— эту операцию повторяют трижды. Вы- 20 сушенный на воздухе,и размельченный на шаровой мельнице фибрин готов к употреблению. 2 мг фибрина суспенэируют в 1 мл 0,01 М трис-НС1. буфере рН 7,8-8,0, вносят 1 мл ферментного 25 раствора в аналогичном буфере, содержащем 50-100 мкг активного белка (соотношение субстрат-фермент 40: 1;

20: 1) . Инкубацию проводят при .36-38 С 20-40 мин. Реакцию прекращают фильтрованием через мембранный фильтр N - 3.

 — длительность реакции, пересчет на минуту.

1000 — коэффициент пересчета на мг. белка.

Д х 1000 55 2 х 1000

ФА = К вЂ вЂ вЂ --0,5

А х В 50 х 20 где К сравнительный коэффициент, позволяющий сопоставить результаты предлагаемого способа с известным; количество тирозина, освобожденного в результате реакции по калибровочной кривой; количество активного белка, внесенного в реакционную смесь;

Фильтрат спектрофотометрируют против контроля при длине волны

280 нм. Контролем служит реакционная смесь, которая фильтруется сразу после внесения ферментного раствора. По калибровочной кривой определяют количество освобожденных аминокислот (по тирозину), соответствующее полученной оптической плотности. Фибринолитическую активность ферментного раствора рассчитывают по формуле

Д х 1000

Ах В

Пример 2. Готовят фибриновый порошок способом, согласно примеру 1, затем берут 2 мг .фибринового порошка, суспензируют в 1 мл 0,01 М

НС1-трис буфере рН 8,0, вносят 1 мл ферментативного раствора в аналогич40 ном буфере, содержащем 100 мкг активного белка (соотношение субстратфермент ?О:1). Инкубацию проводят при 38 С 40 мин. Реакцию прекращают фильтрованием через мембранный

45 фильтр 3. Спектрофотометрирование фильтрата проводят при длине волны

280 н.м. Стандартная кривая аналогична примеру 1. Фибринолитическая активность в этом случае составляет

50 26.7+ 2 1 мкг тирозина мг белка мин

Пример 3 (оптимальный режим).

Готовят фибриновый порошок способом, аналогичным примеру 1, затем берут

2 мг фибринового порошка, суспензируют в 1 мл 0,01 М НС1-трис буфере рН 7,9, вносят 1 мл ферментативного раствора в аналогичном буфере, содер1211292,мкг тироэина

28,1+ 2,5 - — — — — -" — - ° мг белка мин

Составитель Л. Шилина

Редактор Н. Горват Техред Ж.Кастелевич Корректор С Шекмар

Заказ 610/31

Подписное

Тира к 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з жащем 75 мкг активного белка (соотношение субстрат-фермент 30:1). Инкубацию проводят при 37 С 30 мин.

Реакцию прекращают фильтрованием через мембранный фильтр 3. Спектро-. фотометрируют фильтрат при длине волны 280 н.м. Стандартная кривая аналогична примеру 1. Фибринолитическая активность .в этом слу— чае