Способ определения фибринолитической активности препарата стрептокиназы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЯИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

+ exp (9-0, ЗТ), k где

Т: 30 (= Оэ435 Ау () (2) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3844306/28-13 (22) .16.01.85 (46) 07.07.86. Бюл..№, 25 . (71) Ленинградский научно-исследова-! телЛ кий Йнститут вакцин и сывороток (72) В.Н.Алексеева, Б.И.Фейгельман, М.М.Немирович-Данченко, В.В.Лебедева, Н.М.Шашкова и Л.К,Берестовая (53) 576.8.093 (088.8) (56) Taylor F.Â., Tomar Н.R. Methods

Ensymol. — 1970, 19, р. 807-21, Коников A,II, К вопросу о природе стрептококкового фибринолизина. — В кн.: Детские капельные инфекции. Труды института эпидемиологии, микробиологии и гигиены им. Пастера. Л.: .Медгиз, 1953, с. 35-46. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА

СТРЕПТОКИНАЗЫ, предусматривающий формирование фибринового сгустка путем обработки раствора фибриногена тромбином в присутствии контролируемой пробы препарата, проведение и учет реакции фибринолиза с последующим расчетом фибринолитической активности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и снижения его трудоемкости при формировании фибринового сгустка используют 2,0-4,0 ед. тромбина на 1 мп раствора фибриногена, при этом в растворе фибриногена учиты1 вают концентрацию коагулируемого

„„SU„„1242522 А1

gg 4 С 12 N 9/70; С 12 Q 3/00/, С 12 Q 1/56 (С 12 N 9/70, С 12 R 1:46) белка, а фибринолитическую активность рассчитывают по формуле (= 0,087 — (1+0,04(37-7) J(-- ) +

Ах Г 1 30 фибринолитическая активность, ME,/мл; разведение контролируемого препарата стрептокиназы; отношение объемов растворов контролируемого препарата и фибриногена, взятых в реакцию; концентрация коагулируемого белка в растворе фибриногена, мг/мл; время лизиса, мин; температура проведения реак.ции фибринолиза, С.

2. Спосоо по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в процессе реакции фибринолиза смесь термостатируют при 37 С, а фибринолитическую активность рассчитывают по формуле где (» х, t имеют те же значения что в формуле (1).

12425

Изобретение относится к прикладной микробиапогии и может быть использовано для контроля полуфабрикатов и препаратов стрептокиназы медицинского и ветеринарного назначения.

Цель изобретения — повышение точности способа и снижение его трудоемкости.

В основе предлагаемого способа лежит установленная закономерность, 10 заключающаяся в пропорциональности измеряемого значения фибринолити- ческой активности и концентрации коагулируемого белка. Кроме того, установлен трансцендентный характер II 5 зависимости времени лизиса фибринового сгустка от разведения стрептокиназы, что отражено введением показателя степени для множителя, показывающего, во сколько раэ факти- 20 ческое время лизиса отличается от

30 мин, т.е. от времени лизиса сгустка одной единицей фибринолитической активности стрептокиназы. Эта зависимость получена путем обработ- 25 ки более 500 анализов и характери— зуется корреляционным отношением

0,99, что свидетельствует о том, что положенная в основу измерений закономерность является практически строго функциональной.

При 37 С лизис фибринового сгустка наступает при наибольшем разведении контролируемого препарата (при прочих равных условиях). Иэ этого следует два практических вывода: наибольшая точьйзсть измерений дос тигается в точке экстремума, т.е. при термостатировании реакционной смеси при 37 С, поскольку в точке экстремума влияние помехи минималь40 но; поскольку при проведении анализов установка задания по температуре не представляет сложности, имеет смысл работать только в наиболее предпочтительном режиме, т.е. при 37 С. о

При использовании этой температуры расчет ведут согласно выражению

Ах 30

0 087 -- (— ) . (3) 50

С t

Реакцию фибринолиза удобно проводить в термостате с прозрачной стенкой типа ТПС, где осуществляется водяной подогрев проб, внесенных в . пробирки Уленгута . В таком случае

55 для нормального заполнения пробирок реакционную смесь можно готовить из расчета 0,2 мл разведения стрепто22 2 киназы на 1 мл раствора фибриногена (это соотношение ингредиентов имеется в известном способе), т.е. при

С = 0,2. В данном случае (при Т вЂ” 37 С) выражение (3), в свою очередь, упрощается и принимает вид

30 л З 1 := 0,435 Ах (— ) (4)

В табл. 1 представлены результаты измерения фибринолитической активности лечебной стрептокиназы (препарат, действующим началом которого является стрептокиназа) при различной температуре термостатирования реакционной смеси и следующих адекватных условиях анализов: С = 0,2; х =

0,58 мг/мл, активность тромбина

2,0 ед. В табл. 1 показаны три серии измерений, каждая из которых включает пс четыре пробы с разными разведениями стрептокиназы.

В связи с тем, что в предлагаемом способе учитываются все пробы, в табл. 1 дана статистическая характеристика результатов измерений в виде средних значений Y и среднеквадратических отклонений (СКР). Для учета реакции по известному способу статистическая оценка не дается, так как учитывают реакцию лишь в двух пробирках, что при двух определяемых операндах формулы дает число степеней свободы f = О.

Как видно из табл. 1 результаты определения по формуле Коникова не только резко отличаются от получаемых величин в МЕ на 1 мл по номиналам но и по влиянию на них темпера9 туры (в известном Способе на 17,928,5Х в предлагаемом на 3,3-4,1%).

При этом отличия результатов измерений фиб ринолитич е ской активно сти при различных температурах в предлагаемом способе при 57-ном уровне значимости статистически не значимы.

Влияние активности тромбина на pet зультаты определения фибринолитической активности препарата стрептокиназы (С=0,2; Т=37 С; x=5,0 мг/ил) приведено в табл, 2.

Данные табл. 2 иллюстрируют влияние . содержания тромбина на результаты определения фибринолитической активности одного и того же препарата стрептокйназы при прочих адекватных условиях (С = 0 2; Т = 37 С; х =

5,0 мг/мл).. Статистическая обработка этих, а также других результатов (проанализировано 60 измерений) по3 12425 казывает, что при P = 0,05 результаты измерений при активности тромбина

<,5 — 4,0 ед. различаются незначимо.

Вместе с тем, точность измерений при содержании тромбина 1,5 ед. значитель-5 но ниже, чем в диапазоне 2,0 — 4,0 ед, что видно, в частности, из графы CKO.

При оптимальном содержании тромбина, равном 3,0 ед., среднеквадратическая ошибка измерений минимальна. Увели- 10 чивать содержание тромбина свыше

4,0 ед. нецелесообразно как по сообра. жениям точности анализа, так и экономного расходования тромбина.

Несмотря на отсутствие значимых 15 различий,. данные табл.2 при содержа- нии тромбина 2,0; 3,0 и 4,0 ед. проанализированы методом корреляционного анализа (данные при 1,5 ед. тромбина не учитывались). При этом коэффициент линейной корреляции равен 0,58, что свидетельствует о слабой корреляционной связи рассматриваемого фактора с результатами измерений. Поскольку предложен метрологический способ, имеет смысл проводить измерения лишь при оптимальном режиме, характеризуемом использованием

3,0 ед. тромбина.

В табл. 3 приведены результаты определения фибринолитической активности эталонного препарата стрептокиназы, содержащего 250 тыс. ИЕ/мп (измерения проведены при Т = 37 С; о

С = 0,2; 3,0 ед. тромбина в различных концентрациях коагулируемого белка).

В табл. 3 для сравнения приведены результаты контроля, полученные по известному способу. Для оценки результатов используют выражение (4).

Значения фибринолитической активности, определенные предлагаемым способом, подвергнуты статистической обработке, а для значений, полученных известным способом, приведены только их величины, так как последние результаты не относятся к известному способу (в нем. не предусмотрена опе- . рация установления концентрации коагулируемого белка), а лишь дают представление о невозможности учета 50 результатов в данном случае.

При технической реализации предлагаемого способа применяют следующие, воспроизведенные.в .примере 1, мето- 55 дики определения и установления концентрации ингредиентов реакционной смеси:

22 определение активности тромбина по В.ФС 42-180-72; .определение концентрации коагулируемого белка по Бидвелл.

Результаты контроля эталлонного пре. парата стрептокиназы активностью

250 тыс. ME/ìë приведены в табл.3.

Пример 1. Операция 1. Приготовление фибриногена.

Цитратную кровь донора центрифугируют в течение ?О мин при 6 С и факторе разделения F =2000. Плазму отсасывают и вливают в охлажденный до о

О C насыщенный раствор хлористого натрия.из расчета !00 мп плазмы на

200 мл раствора хлористого натрия.

Смесь встряхивают и выдерживают при — 12 С в течение 2 ч, после чего осао док отделяют центрифугированием и растворяют в.0,5%-ном растворе лимоннокислого натрия, объем которого равен I/10 исходного объема плазмы. Раствор подвергают диализу в те чение 24 ч при 3 С против 100-кратного объема 0,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, осветляют центрифугированием и лиофилизируют;

Операция 2. Определение коагулируемого белка по Бидвелл.

К 0,2 мл пробы испытуемого раствора фибриногена добавляют 4,8 мл мединалового буфера рН 7,4 и 0,1 мл тромбина. Данную смесь термостати- о руют при 37 С в течение 1 ч, после чего образовавшийся сгусток промыи, вают охлажденным до 8 С !1,85%-ным раствором хлористого натрия, отжимают жидкость на фильтровальной бумаге и.переносят осадок в пробирки с 2 мп

О,! М раствора едкого натра. Пробирки кипятят до полного растворения сгустка (в течение примерно 100 мин), охлаждают до комнатной температуры и добавляют в них по 6 мл 12,5% †но раствора углекислого натрия, 1 мл

0,01 M раствора сульфата меди, перемешивают, а затем через 10 мин вносят ло 1 мл разбавленного 1:I дистиллированной водой раствора Фолина-Чикалтеу.

Через 30 мин производят спектрофотометрирование приготовленных препаратов при длине волны 750 нм, результаты измерений усредняют (по всем пробиркам) при этом устанавливают содержимое коагулируемого бел-. ка путем сравнения результата спект1242522 рофотометрирования испытуемых образцов с градуировочной кривой, построенн6й предварительно для раство- . ров с известной концентрацией белка.

Операция 3. Стандартизация раствора фибриногена.

Исходя из содержания коагулируемого белка в препарате фибриногена, определенного на предыдущей операции, содержимое ампулы с лиофилизированным фибриногеном серии растворяют в таком объеме 0,06 М фосфатного буфера рН 7,4 — 7,6, чтобы кон-. центрация коагулируемого белка в растворе, фибриногена составила 0,040,6 мас.X.

Готовят следующий ряд растворов фибриногена по содержанию коагулируемого белка: 0,04", 0,058",0,1;, 0,25;

0,4; 0,5,и 0,6 мас.X.

Операция 4..Определение активности тромбина по ВФС 42-180-72. о

В водяной термостат при 37 С помещают сухие агглютинационные пробирки, в которые наливают по 1 мл свежей цитратной плазмы и выдерживают

2-3 мин. Затем к плазме приливают

1,мл препарата тромбина. Учитывают время образования сгустка. Если сгусток образовался. ранее чем эа 30 с, исходный раСтвор тромбина разбавляют до тех пор, пока не будет образовываться сгусток за 30 с. Разведение при котором время образования. сгуст- ка равно 30 с, соответствует 1 ед. активности тромбийа.

Операция 5. Стандартизация тромбина.

В соответствии с результатами, полученными на предыдущей операции, тромбин разводят 0,85Х-.ным раствором хлористого натрия таким образом, чтобы в 0,1 мл раствора содержалось

2,0 — 4,0 ед. активности тромбина.

В примере берут разведение с активHGcTbEo тромбина 3,0 ед.

Операция 6. Постановка реакции фибринолиэа.

Для растворения контролируемого препарата стрептокиназы готоВят

0,06 М фосфатный буферный раствор рН 7,4 — 7,6, содержащий стабилизатор (0,3 мас.% желатины). Этот буферный раствор получают смешением . следующих ингредиентов, мл:

0,158 М Ма,НРО 80

0,158 М KH POq 20

0,5Х-ный раствор желатины 150

Для предотвращения бактериального загрязнения .к буферному раствору добавляют мертиолят натрия в KoRцентрации 1:1000000. Указанная пропись является типовым растворителем стрептокиназы. Его фильтруют через бумажный фильтр и хранят при 26 С. Раствор годен в течение 1 мес.

1О

Поскольку в данном примере анали. зируют разведения одной пробы преСодержимое ампулы с лиофилиэиреванным препаратом стрептокиназы, 15 подлежащим контролю, растворяют .в 1 мл приготовленного фосфатного буфера. Из этого раствора готовят путем последующего разведения тем же буфером испытуемые образцы препа20 рата. При этом! разведения выбирают в зависимости от ожидаемой активности препарата °

В агглютинационные пробирки вносят по 0,2 мл исследуемых разведений

25,стрептокиназы, по 1 мл раствора фибриногена из укаэанного в описании операции 3 ряда и по 1. мл тромбина с установленной при выполнении операции 5 активностью. Таким образом, 30 учитываемые характеристики реакционной смеси составляют: С = 0 2 активность тромбина 3,0 ед., концентрация коагулируемого белка из ряда 0,4; 0,58; 1,0; 2,5; 4,0; 5,0;

З5 6 0 мМ"л . Реакционные смеси встряхивают, через 15-20 с проверяют наличие образовавшегося фибринового сгустка осторожным наклоном пробирок и поме4(1 щают в водяной термостат с прозрачной стенкой (для визуального наблюдения о эа ходом реакции) при 37 С. Для каждой пробирки измеряют время,. в течение которого произойдет лизис

45 сгустка. При этом об окончании реакции судят по подъему мелких пузырьков воздуха, появляющихся в сгустке фыбрина при нагревании.

Фибринолитическую активность контролируемого препарата рассчитывают на основании исходных данных и выявленного времени лизиса по выражению (4) .

Результаты определения фибринолитической активности приведены в табл. 4

1242522 парата, определяют среднее значение фибринолитической активности, которое приведено в табл.4 для каждой концентрации коагулируемог белка, а также для всей серии анализов.

В результате установлена концентрация стрептокиназы в пробе

14,2 тыс. NE/мл,. СКО 1,15.

Пример 2. Препарат стрептокиназы контролируют, как описано в примере 1, при следующих характерисО тиках испытания: С = 0,4; Т = 40 С; х = 0,63 мг/мл.

Подставляя значения указанных параметров в выражение (1), его преобразуют к виду

4)ФБ =0,137А 1,36.(30/t) 25

= 0,1863 А (30/t) (5) и учитывают результаты реакции фибринолиэа.

В данном примере для четырех разведений контролируемой пробы стрептокиназы ставят по четыре параллельные реакции. В расчет берут время лизиса по соответствующим параллельным опыта. Далее по выражению (5) рассчитывают фибринолитическую ак-. тивность и СКО для калщого разведения стрептокинаэы, а затем для всех проведенных испытаний.

Результаты определения фибринолитической активности приведены в табл. 5.

Пример 3. Контроль фибринолитической активности культуральной жидкости стрептококка .

Культуральную взвесь Streptococcus

equisimilis шт. 921/18 освобождают от микробной массы фильтрованием через бумажный фильтр, 0,1 мл разведенной полученной культуральной жидкости используют для постановки реакции фибринолиэа, которую проводят, как описано в примере 1. Условия проведения реакции: С = 0,1; Т = 36 С; х = 1,О мг/мл.

Подставляя условия проведения реакции в выражение, последнее преобразуют к виду (= 0,87r1,04(30/t) а,3 7= 0,905(30/t) (6) Результаты реакции, рассчитанные по выражению.(6), приведены в табл.6.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность и снизить трудоемкость определения фибринолитической активности препаратов стрептокиназы.

Уменьшение трудоемкости обеспечивается тем, что отпадает необходимость в постановке параллельных проб в окрестности учитывавшихся в известном способе разведений контролируемой пробы.

Преимуществом предлагаемого спосо45 ба является его стандартизация, т,е. обеспечение возможности изменения фибринолитической активности стрептокиназы в международных единицах, тогда как в известном способе измерения ведутся в не сопоставимых с ними единицах Коникова.

Учет реакции ведется по всем анализируемым разведениямстрептокиназы, что является одним из факторов, обеспечивающих повышение точности

25 способа. Другим фактором повышения точности контроля в предлагаемом

1 способе является учет параметров, влияющих на оценку результата, и прежде всего концентрации коагулируемого белка в растворе фибриногена.

О влиянии этого параметра на точность измерений можно судить иэ сопоставления даниых третьей и шестой колонок табл. 3, из которых видно, что при различном содержании коагулируемого

35 белка реакции предлагаемый способ дает близкие результаты (средняя ошибка 27, максимальная ошибка 6,7X)> тогда как учет результатов соответствующих реакций по известной форму40 ле дает значения, сильно отличающиеся одно от другого((от 498,7 до

4851,5 тыс. ед. Коникова/мл).

1242522

Таблица I

Т, оС

По формуле Кони- По .формуле (4) кова (3) тыс.ед. Отклонемл ние от тыс. ME аксиума, %

14,7

3,9 3,3

11,7 243,8 17,9

35 10

22,5

30,5

100

38,9

8,0 297,1

37 10

15,2

0,5

17,5

26,0

43,5

100

40 10

9,4

15,6

0,2 4,1

22,3

34,5

59,7

100

Т а б л и ц а 2 т

У СКО тыс.ИЕ/Мл

Вр ли

1,5 1

14,4

11,2

2,7

12,3

13 5

10,1

21,5

37,6

10,4

11,8

I,0

ll 7

Разведение

А 10

Время лизиса мин

Результаты. измерений

212,3 28,5 (известный способ) СКО Отклоне1

I ние от макси мума, %

242522!

Продолжение табл.2 — — — — —..---- —.,—. — —,— 4---3 4 5 . б

11,8

13,1

12,2

31,5

12,1

0,2

3,0 1

12,4

13,5

12,3

12,7

12,5

12,5

14,4

ОФ9

4,0

13,1

12,9

17,5

13,1

11,9

30

13,0

Таблица 3СКО Ошибка, Ж от активАктивность, тыс. ед./мл

Фибринолитическня активность тыс.ИЕ/мл ности этанола

23,9

7 244,3

7 266,7

0,58

-2,3

1,0

31,1

+6,7

9 254.,3

5 240,6

9 259,9

9 257,7

17;0

1,7

+1,7

2,5

5l,9

-3,8

37,1

+4,0

5,0

4.3, 1

6,0

33,8

Среднее значение

254., 9. +2,0

3l,8

Коагу- Колилируе- честмый во . белок анака мГ/MI лизов

4851,5

3397,0

1661,7

921,0

570,6

498,7

1242522

l3

CK0

0,4

14,1

15,35

0,86

13

l5 5

15,8

100

32 - 16,0

14,87,0,58

l4,1

0,67

17,5

15,3

15,2

50

14,4

14,83

1,0

0,84

IO

14 3

19

15,8

2,5

13,5

l,21

10,5

15,5

12,8.

4,0

15,5

12,3

13,2

0,96

13,0

10

l4 2

5,0

14,4

13 6

0,86

12,7

l3,8

6,0

14,6

13 6

1,05!

3,7

12,5

Среднее значение

14,2

1,15

КоагулируеМИЙ белок х, мг/мн

Разведение

А 10

Время лизиса мин

19 5

Y „ тыс . ИЕ/мп

Таблица 4

Среднее значение

У, тыс. МЕ/мл

16

1242522 а б л и ц а 5

Ю 1 (, тыс.МЕ/мп

РазвеВремя лизиса, мин е1 t2 "3

СКО дение

А ° 10

1,9

5 7 4,5

9 11,5 .8,5

7,9

8,0

1,2

18 5 21 17

1,2

9,8

20,5

10,7

1,0

25,5 28,5 25

Среднее значение

9,1

1,8

Таблица 6

Время лизиса, мин

"L I""!

ME/мл СКО

Разведение

7 75 8 6075

16 16,5 17,5 608,8

100

55,6

300

37,6

22,5 23,5 24 639,2 29,0

500

39 37 42 627,2

54,2

1000

Составитель В. Голимбет

Техред О.Сопко

Корректор С.Черни

Редактор В.Петраш

Заказ 3668/26

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4