Способ выделения иммунодепрессора из тканей млекопитающих

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ6ЛИН

„„SU„„1243730 (59 4 А 61 К 35/00// А 61- К 35/12 РУ Р) 11 Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3811502/28-14 (22) 13.11.84 (46) 15.07.86. Бюл. Р 26 (71) Харьковский научно-исследовательский институт медицинской радиологии (72) С.М.Гринберг, В.Г.Пухальская, В.А.Бабичев, Л.С.Толвинская и И.Б.Жукова (53) 615.45 (088.8) (56) Chisari F.V. ?.Immuno 6. 1978, 121.4, р.1279-1286. (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОДЕПРЕССОРА ИЗ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ путем гомогенизации ткани с последующим центрифигурованием гомогената, солевым фракционированием супернатанта, хроматографией осадка и лиофилизацией целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, перед фракционированием супернатант нагревают до, о

65-80 С, осаждают ацетоном, а солевое фракционирование проводят при

60-803.насыщения и хроматографию— на ионообменнике.

1243730

Изобретение относится к фармацев- тической промышленности и касается получения биологически активных веществ, Обладающих фармакологическим действием. 5

Целью изобретения является упрощение способа получения иммунодепрессора из животного сырья.

Способ осуществляют следующим образом, lI0

Исходное сырье (печень, селезенка, тимус, сыворотка крови) гомогенизируют в физиологическом растворе, цечтрифугируют и супернатант нагревао ют до 65-80 С для удаления термола- >5 бильных белков. Просветленный фильтрованием раствор высапивают сульфа— том аммония при 60-807 насыщения, преципитат растворяюr в воде и обезвоживают ацетоном. Полученный на 70 этом этапе порошок-сырец можно хранить продолжительное время при (+ )— (+!5) С. !

На следующем этапе порошок-сырец

7$ растворяют и очищают м"-тодом ионнообменной хроматографии.

Пример . 1 кг печени быка гомогенизируют в 2000 мл фи зиологического раствора, центрифугируют при 1000g 15 мин при 4 С. Полученный о ° 30 супернатант при перемешивании нагревают до 75 С, охлаждают до 10 С и денатурированнъ.е белки Отделяют фильтрованием, К фильтрату добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 507.-ного насыщения и выдержи-. вают на холоде 1 ч. Далее центрифугированием при 1000п 20 мин удаляют образовавшийся осадок, а к супернатанту вновь добавляют сульфат аммо40 ния до 75%-ного насьпцения и оставляют на холоде 1 ч. Образовавшийся преципитат собирают центрифугированием, растворяют в 300 мл воды и смешивают с 10 объемами охлажденного до -15 С ацетона. Через 1 ч Образовавшийся прецигитат отделяют от растворителя фильтрованием под вакуумом. Осадок промывают на фильтре в 500 мл охлажденного ацетона.

Получают 1,8 г сухого порошка кремового цвета. Содержание белка (по Лоури) 86%. Методом электрофореза на бумаге при стандартных условиях разделения белков сыворотки крови определяют состав образца. Препарат содержит,%: альбумин 42,7; альфа-1— глобулин 8,5; альфа-2-глобулин !0,6;

14,8% бела-глобулин 14,8; гамма-глобулин 23,4, На втором этапе 300 мг препарата (порошка-сырца) растворяют в 20 мл

0,01М фосфатного буфера, рН 8,15.

Полученный раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной тем же буфером. Размер колонки 20xl,5 см. Колонку промывают 0,2М фосфатным буфером, рН 8,,15., затем 1М раствором NaC1 и затем активную фракцию элюируют

0,1н,Na01I. Выход белков регистрируют на проточном денситометре.

Активную фракцию обессоливают на колонке с сефадексом G-25 и при необходимости лиофильно высушивают.

Испытание биологической активности препарата проводят методом локального гемолиза в геле на модели первичного иммунного ответа животных. Для этого мьппам линии СВА вводят исследуемый препарат внутрибрюшинно в физиологическом растворе за сутки до иммунизации. В качестве антигена используют 57.-ную взвесь эритроцитов барана. Контрольная группа животных получает равный Объем физислоческого раствора. На 5-е сутки животных забивают, извлекают селезенки и готовят иэ них взвесь клеток .

Взвесь клеток от каждой мыши помещают в отдельную пробирку и добавляют туда эритроциты барана до конечной концентрации 57. и 1%-ньпл раствор агара, приготовленного на солевом растворе Хэнкса и нагретого до

О

48 С. Содержимое пробирки перемешивают и равномерно распределяют по поверхности чашки Петри, После застывания агаровой смеси чашки переносят в термастат на 1,5 ч. Далее в каждую чашку добавляют по 2 мл комплемента морскои "винки, разведенного в

10 раз физиологическим раствором, и снова инкубируют в термостате 40 мин, Затем чашки извлекают и подсчитывают зоны лизиса на их поверхности.

Первая эона лиэиса образуется одной антителообразующей клеткой (АОК).

Общее. число антителообразующих клеток в селезенке каждой мьппи подсчитывается с учетом разведения клеточной взвеси, Например, селезенку мьппи гомогенизировали в 2 мл физиологическОго раствОра и в Опыт взяли 0 1 мл т.е. 1/20 ч. Следовательно, число

1243730

Результаты иммунодепрессивной активности образцов приведены в таблизон лизиса на чашке Петри необходимо умножить на 20. Полученные данные обрабатывают статистически. це.

Исследуемый образец

Число Число

АОК ЯСК (МЛн) Серия

Доза

Вес селезенки, Ж к контролю

41500+ 108+7

+2400

96+5,0

Контроль

Физиологичес- 0,5 мл кий раствор

Опыт 1 "Сырец"

8000+ 103+8

+210

:2 мг

10917 в

0,5 мл физиологического

4500+ 98+1 1

«+1 700

87 9 го раствора

П р и м е ч а н и е: ЯСК вЂ” число ядросодержащих клеток в селезенке, подсчитывается в каме-. ре Горяева.

В предложенном способе сокращение временных и трудовых затрат обусловлено применением низкоскоростного центрифугирования, что позволяет использовать роторы с большим рабочим обЪемом и меньшим временем разгона и остановки, а также отсуствием длительного процесса диализа и возможностью накопления больших количеств

Составитель Л.Шилина

Редактор М. Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытг

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ 3735/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðoä, ул.Проектная, 4

Опыт 2 Препарат после ионнообменной хроматографии раствора

0,008 мг в 0,5 мл физиологическопромежуточного продукта-сырца, что в свою очередь позволяет применять хроматографические колонки большей емкостью и приводит к сокращению трудозатрат при очистке препарата, и о кроме того, заменой гельфильтрации на ионнообменную хроматографию, обладающую большей емкостью и скоростью разделения.