Способ определения нейротропной активности биологически активных веществ

 

Изобретение относится к медицине и может, быть использовано для фармакологических испытаний и скрининга биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение способа, повышение чувствительности и дополнительное определение ГАМК-потенцйрующей активности веществ. Цель достигается за счет использования изолированного спинного мозга крыс. Готовят срезы спинного мозга. Помещают его в перфузионный отсек на 20 мин. Затем регистрируют изменение электротонических потенциалов (ЭПТ) дорсального корешка, вызываемых воздействием на спинной мозг ГАМК (1 х X ) в присутствии исследуемого вещества. Для этого регистрируют исходный деполяризационный ЭТП .дорсального корешка при воздействии на спинной мозг ГАМК. Затем мозг отмывают в течение 10 мин раствором Кребса и суперфузируют 15 мин раствором исследуемого вещества () . На 15-й мин контакта среза мозга с этим веществом на мозг вновь воздействуют ГАМК и регистрируют ЭТП в дорсальном корещке. Затем мозг 10 мин отмывают раствором Кребса и повторяют все процедуры с исследуемым веществом в концентрации 1х10 М. 2 табл. i СЛ 1C 4 О5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1246001 (50 4 G Ol N 33/15

ГОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3733039128-14 (22) 07.03.84 (46) 23.07.86.Бюл. N - 27 (71) Донецкий медицинский институт им.M.Ãîðüêoãî (72) И.И.Абрамец и И.В.Комиссаров (53) 615.78 (088.8)

I(56) Авторское свидетельство СССР !

11 969910, кл. С 01 N 1/28, А 61 В 10/00, 1982. рованного спинного мозга крыс. Готовят срезы спинного мозга. Помещают

его в перфузионный отсек на 20 мин.

Затем регистрируют изменение электротонических потенциалов (ЭПТ) дорсального корешка, вызываемых воздействием на спинной мозг AMK (1 х 1О M) в присутствии исследуемого вещества. Для этого регистрируют исходный деполяризационный ЭТП,дорсального корешка при воздействии на спинной мозг AMK. Затем мозг отмывают в течение 10 мин раствором

Кребса и суперфуэируют 15 мин раствором исследуемого вещества (1х10 М).

На 15-й мин контакта среза мозга с щ

C этим веществом на мозг вновь воздействуют I AMK и регистрируют ЗТП в дорсальном корешке. Затем мозг 10 мин отмывают раствором Кребса и повторяют все процецуры с исследуемым ве- Я ществом в концентрации 1х10 М.

2 табл. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОТРОПНОЙ

АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для фар макологических испытаний и скрининга биологически активных веществ. Цель изобретения — упрощение способа, повышение чувствительности и дополнительное определение AMK-потенцирующей активности веществ. Цель достигается за счет использования изолиОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1246001

Изобретение относится к медицине, в частности может быть использовано для фармакологических испытаний и скрининга биологически активных веществ.

Цель чзобретения — упрощение способа, повышение чувствительности и дополнительное определение ГАМК-по) тенцирующей активности веществ.

Цель до< тигается за счет использования в качестве биологического препарата изолированного спинного мозга крыс, суспендированного в солевом растворе Кребса.

Способ осуществляется следующим образом.

У крысят 7-14-дневного возраста под глубоким эфирным наркозом извлекают часть позвоночного столба между нижними грудными и поясничными сегментами. По звоночный столб помещают на 5 мин в чашку Петри в охлажденный до 10..12 С раствор Кребса, который интенсивно аэрируют кисло— родом. ЗаТем путем двусторонней ламинэктомии 1из позвоночного столба извлекают спинной мозг с отходящими от него вентральными и дорсальными корешками, который подвергают гемисекции в сагитальной плоскости и помещают в перфузионный отсек сахарозного мостика (половину спинного мозга — 2-3 сегмента — с дорсальными и вентральными корешками),, где его суперфузируют оксигенированным модифицированным раствором Кребса следующего состава, мМ/si: Na0E 118;

КНгРОл 1; СаС1 2,5; МаНСО 24; глюкоза 10; рН 7,3+0,1. Ширина сахарозной щели 500 мкМ, скорость протекания сахарозы 1 мл/мин сопротив— ление 0,3 If раствора сах,арозы 2-5 х х 10 Ом/см.

Далее с помощью хлорсеребряных электродов регистрируют разность потенциалов между дистальным концом корешка и спинным мозгом, которые электрически разобщены сахарозным промежутком. указанную разность потенциалов усиливают дифференциальным усилителем постоянного тока от векторэлектрокардиоскопа ВЭКС-1 и регистрируют фотографически с экрана осцилоскопа или с помощью самопишущего гальванометра (КСП-4). При этом регистрируют, частоту спонтанньгх разрядов B вентрапьнь х и дорсапьных коре ; paз..тн ныг виды вызван— ных ответов на ортодромную стимуляцию; изменения уровня поляризации мотонейронсв и терминалей первичных эфферентов и реакции на аппликации определенных медиаторов.Все параметры регистрируют до воздействия нейротропных веществ в момент их воздействия и при отмывании спинного мозга. Они отражают динамику возник— новения эффекта и его исчезновение при 0TMhlBBHHH. IIpH этом учи бывают, что параметры первой и второй групп отражают синаптическую передачу в спинном мозге, а параметры третьей группы отражают суммарные постсинаптические потенциалы мотонейров и терминалей первичных афферентов.

Сахарозный. мостик формируется через 20-25 мин от момента помещения о спинного мозга в перфузируемый отсек, при этом спонтанная и вызванная элек25

45 трическая активность корешков приобретает стабильный характер, после чего приступают к исследованиям. Концентрации веществ, которыми воздействуют на спинной мозг, колеблются от 10 до 10 М. Опыты проводят при комнатной температуре (20-24 С).

Время испытаний нейротропной активности одного фармакологического средства 4-6 ч в зависимости от особенностей спектра исследуемых веществ а для оценки общего характера нейротропного действия одного испытуемого вещества достаточно четырех опытов на четырех крысах.

Пример 1. Подготовку срезов спинного мозга 11-дневного крысенка осуществляют указанным образом. Через 20 мин после помещения спинного мозга в перфузионный отсек регистрируют изменения электротонических потенциалов (ЭТП) дорсального корешка, вызываемые воздействием на спинной мозг ГАМК (1х10 4 M) в присутствии хлордиазепоксида гидрохлорида.

Для этого регистрируют исходный деполяризационный ЭТП дорсального корешка при воздействии на спинной мозг ГАМК, после чего мозг отмы— вают в течение 10 мин раствором

Кребса,, а затем суперфузируют 15 мин раствором, содержащим хлордиазепоксид (1x10 М). На 15-й мин контакта среза глозга с хлордиазепоксидом на него вновь воздействуют ГАМК и регистрируют деполяризационный ЭТП в дор альном корешке. Затем мозг

1 246001

Таблица 1

Т

Деполяриэационные ЭТП дорсальных корешков, обусловленные воздействием на спинной мозг

ГАМК (1 х 10 М) в опыте

Концентрация хлордиаэепок сида, М

1,О> О, I

1,22 0,1

l,62 О,!

0,92

l 32

0,88!,ОУ

1 х 10

1,10

1,52

I 04

1,22!,84 х 10

1,48

1,40

1,76

Т а б л и ц а 2 ационные электричесвентральных ко) 3 Т 4

Гиперполяриэ кие потенциалы решков в опы

) 1

IxlO

2x1 0

0,25 0,28

0,34 0,32

0,32

0,36

1 x1 0

0,43

l 0 мин отмывают раствором Кребса и повторяют все процедуры с хлорди-а аэепоксидом в концентрации Ixl 0 M.

Из табл. I видно, что исследуемое нейротропное средство — хлордиазепоксид, усиливает воздействие на, спинной мозг ГАМК вЂ” ответы терминалей первичных афферентов. Иейротропное действие хлордиазепоксида проявляется медиаторпотенцирующим действием (ГАМК-потенцирующим) и может быть охарактеризовано коли-чественно, например, по величине

ЕС5,, т.е. концентрации хлордиаэепоксида, в присутствии которой стандартный эффект ГАМК возрастает на

50Х. Зта концентрация может быть найдена иэ индивидуальных опытов и составляет 1,2+0,3xl0 M. По известному способу ГАМК-потенцирующая активность определена быть не может.

Пример 2. Подготовку срезов спинного мозга 10-дневных крысят осуществляют, как и в предыдущем примере. Регистрируют ЭТП вентральных корешков, вызываемые воздействием на спинной мозг дофамина в концентрации 1 ° 10 и 2 10 М в отсутствие и в присутствии галоперидола в конКонцентрация вещества, M

Галоперидол Дофамин

Результаты опытов, полученных на четырех срезах спинного мозга, приведены в табл.1. центрациях i-10 и 1 10 М, т.е. определяют антагонизм нейролептика галоперидола по отношению, к нейромедиатору дофамину.

Через 20 мин после помещения рабочего среза спинного мозга в перфузионный отсек сахарозного мостика

его суперфуэируют раствором Кребса, содержащим дофамин в концентрации

1 ° 1К M. Регистрируют возникающий при этом гиперполяризационный ЭТП вентрального корешка. Затем срез мозга отмывают !О мин раствором Кребса, содержащим галоперидол в концентра35 ции 1 ° 10 И. На 10-й мин контакта моз-г га с галоперидолом на него воздействуют дофамином в удвоенной концентрации и вновь регистрируют гиперполяризационный ЗТП вентрального ко40 решка. Затем мозг отмывают 30 мин раствором Кребса, после чего 10 мин суперфуэируют раствором Кребса, содержащим галоперидол (1 ° 10 М),и т.д. Результаты опытов на четырех крысятах приведены в табл.2.

1? 46001

Продолжение табл.2

Гиперполяризационные электрические потенциалы вентральных коКонцентрация вещества, М

М m

Дофамин

Галоперидол решков в опыте

1 2

2х10

1xl0

0,19 0,21 0,28

6,80 6,30 6,00 6,40 0,17

0,29

6,50

Величины рА

Составитель А.Агуреев

Редакто Н.Я о р .Яцола Техред О.Сопко Корректор С.Черни

Заказ 3993/37 Тираж 778

ВНИИПИ- Государственного комитета ССС1 по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К--32, Раусшкая «a6., д.

Подписное

4/5

Производственно-полиграфи леское ш ллриятие,г. Ужгород, ул. Г!ро к лая 4

P . . Р

Степень антагонизма галоперидола по отношению к дофамину характеризуют величиной рА<, т.е, отрицательным логарифмом молярной концентрации антагониста, . 2О в присутствии которой удвоанная концентрация агониста дает такой же эффект, как и одинарная его отсутствия. Найденная в каждом опыте величина рА равна 6,40, т.е. 4 10 М. Определение антагонизма по известному способу требует использования га— лоперидола в концентрациях, в 100 и более раз высоких, по сравнению 30

< предлагаемым способом, Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения нейротропной активнос.ти биологически активных веществ путем выделения препарата центральной нервной системы животного, суперфузии его раствором биологически активных веществ в буфере с последующим измерением электрических параметров нейронов, о т л и ч а ю— щ и й: с я тем, что, с целью упрощения иповьпшения чувствительностиспособа, а такжедополнительного определения

ГАМК-потенцирующей активности веществ ° в качестве препарата используют изолированный спинной мозг крыс,а в качест- . ве буфера-солевой раствор Кребса,