Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие синтез производных соматотропного гормона человека, способ их конструирования, штаммы escherichia coli, содержащие эти плазмиды - продуценты производных соматотропного гормона человека (их варианты)

 

(19)RU(11)1248280(13)C(51)  МПК ⁶    _C12N15/18Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина: учтена за 20 год с 09.07.2002 по 08.07.2003

(54) РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ИХ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ ПЛАЗМИДЫ - ПРОДУЦЕНТЫ ПРОИЗВОДНЫХ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА (ИХ ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии и представляют собой рекомбинантные плазмидные ДНК, обуславливающие синтез производных соматотропного гормона человека (СТГЧ), способ конструирования данных рекомбинантных плазмидных ДНК и штаммы - продуценты производных СТГЧ, содержащие эти рекомбинантные плазмиды. СТГЧ синтезируется в аденогипофизе в виде прогормона, содержащего на N-конце дополнительную последовательность из 26 аминокислотных звеньев, так называемую "лидерную" или "сигнальную" последовательность, которая удаляется в ходе процессинга, сопряженного с секрецией гормона. Использование методов генетической инженерии позволяет решить задачу получения полипептидных гормонов человека принципиально новым путем. С этой целью возможно выделение или синтез гена гормона и введение его в бактериальную клетку, например, в составе бактериальной плазмиды, обеспечивающей нормальную репликацию данного гена и его экспрессию и в результате - биосинтез гормона человека в бактериальной клетке. Такой подход применим для получения штаммов бактерий продуцентов СТГ человека или его производных. Известны рекомбинантные ДНК, кодирующие синтез некоторых производных СТГЧ. 1. Описанная в работе (Goeddel D.V. et al. Nature, 1979, 281, 544-548) плазмида включает ДНК векторной плазмиды рВR 322, фрагмент кДНК СТГЧ размером в 551 нуклеотидную пару, химически синтезированный фрагмент ДНК, кодирующий 24 N-концевые аминокислоты СТГЧ и дополнительный АТG - инициирующий кодон и фрагмент ДНК в 285 нуклеотидных пар, содержащий 2 тандемно расположенных UV-5 lac-промотора. Описанная рекомбинантная плазмида обеспечивает биосинтез в клетках E.coli штамма 1776 2,4 мг/л культуры производного СТГЧ, содержащего на N-конце дополнительный остаток метионина, при плотности культуры 3,6х10⁸ клеток на 1 мл. Рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие синтез других производных СТГЧ, в литературе не описаны. Использование методов генетической инженерии позволяет получать различные производные необходимых для медицины и сельского хозяйства полипептидов, отличающихся, в частности, наличием на концах молекулы дополнительных аминокислотных звеньев или, наоборот, лишенных части аминокислотных остатков. Полученные производные могут обладать ценными свойствами, такими как большая устойчивость к протеазам, стабильность, более высокая специфичность или избирательность действия. Они могут использоваться также как модели для изучения роли различных структурных элементов полипептидов для их функционирования. 11. Известный способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез мет -СТГЧ, описанный в работе Goeddel D.V. et al. Nature, 1979, 281, 544-548, состоит в том, что фрагмент кДНК СТГЧ размером 551 нуклеотидная пара, кодирующий аминокислотные остатки 24-191 СТГЧ, полученный путем расщепления клонированной кДНК эндонуклеазой рестриктации Нае III, вводят в Pst I-сайт векторной плазмиды рВR 322 через олиго-dС-олиго-dG-адаптопы (при этом восстанавливая Нае III участки расщепления), получая плазмиду pHGH 31. Отдельно синтезируют олигонуклеотиды, путем сшивания которых получают фрагмент ДНК, кодирующий 24 N-концевых аминокислотных остатков СТГЧ и дополнительный АТG-кодон и имеющий 5'-выступающие липкие концы, соответствующие участкам расщепления рестриктаз ЕсоRI и Hind III. Данный фрагмент встраивают в векторную плазмиду pВR 322, получая рекомбинантную плазмиду рНGH 3. Далее фрагмент EcoRI-Hae III, выделенный из плазмидной ДНК рНGH 3, сшивают с фрагментом Нае III-Xma I, выделенным из плазмидной ДНК рНGH 31, и встраивают полученный полноразмерный квазисинтетический ген СТГЧ в плазмиду, содержащую два тандемно расположенных lac VU-5-промотора, сконструированную на основе вектора рВR 322, получая плазмидную ДНК рНGH 107, а затем путем удаления из участка расщепления рестриктазы ЕсоRI четырех нуклеотидных пар плазмидную ДНК рНGH 107-1. Описанный способ позволяет получить плазмидные ДНК, обеспечивающие прямую экспрессию Мет-СТГЧ. Недостатком метода является необходимость в химическом синтезе набора синтетических олигонуклеотидов (12 олигонуклеотидов размером 12-14 остатков), что является весьма трудоемкой задачей. Использование этого способа позволяет получить только один тип рекомбинантных плазмидных ДНК, обеспечивающих синтез производного СТГЧ. Для получения других плазмид необходимо использовать иные по структуре олигонуклеотиды, что еще более усложняет данную методику. Кроме того, уровень экспрессии Мет-СТГЧ, обеспечиваемый плазмидой, сконструированной описанным методом, является недостаточно высоким. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающий синтез других производных СТГЧ под контролем lac UV-5 или других промоторов в литературе не описан. Известны следующие штаммы-продуценты Мет-СТГЧ:
штамм Е.coli 1776, несущий плазмиду рНGH 107, обеспечивающий выход 2,4 мг Мет-СТГЧ на 1 л культуры при плотности 3,6х10⁸ клеток на 1 мл;
штамм Е. coli 1176, несущий плазмиду рНGH 107-1, обеспечивающий выход 1,4 мг Мет-СТГЧ на литр культуры при той же плотности;
штамм Е.сoli D1210, несущий плазмиду рНGH 107, обеспечивающий выход 1,0 мг Мет-СТГЧ на 1 л культуры при плотности 3,8x10⁸ клеток на 1 мл после индукции синтеза с помощью ИПТГ. Целью предлагаемых объектов изобретения является создание штаммов Е. coli, содержащих рекомбинантные плазмиды ДНК, обеспечивающие синтез различных производных СТГЧ с высоким выходом целевых продуктов. Поставленная цель достигается тем, что сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/р, обеспечивающие синтез различных производных СТГЧ в клетках бактерий и обозначенные авторами рSTH/P-lac, pSTH/P-tac, pSTH/P-trp. В способе конструирования данных плазмидных ДНК для достижения поставленных целей в плазмидную ДНК рBR 322 вносят сначала последовательность кДНК, синтезированной на матрице мРНК из аденомы гипофиза человека, известными методами отбирают плазмидную ДНК, содержащую полноразмерную копию кДНК СТГЧ и обеспеченную р-pre STH, далее путем нуклеазной обработки плазмидной ДНК р-pre STH получают набор плазмидных ДНК, содержащих укороченный ген СТГЧ, встраивают перед началом кодирующей части этого гена инициирующий кодон и затем вводят перед ним фрагмент ДНК, содержащий бактериальный промотор, например двойной lac UV-5-промотор или trp-промотор, или гибридный tac-промотор, получая серии плазмид, обозначенных рSTH/P-lac, pSTH/P-trp и pSTH/P-tac соответственно. Рекомбинантные плазмидные ДНК разных серий обеспечивают в штаммах E. coli синтез производных СТГЧ с различным выходом (далее приведены экспериментальные данные для штамма E.coli К 802). Промоторы, используемые в предлагаемых плазмидных ДНК, являются регулируемыми. Использование индукторов, таких как ИПТГ в случае lac- и tac-промоторов или β-индолилуксусной кислоты в случае trp-промотора позволяют увеличить синтез продуктов в определенных штаммах Е.coli. Для достижения поставленных целей предлагаются также штаммы Е. coli K 802, содержащие одну из рекомбинантных плазмид, сконструированных описанным способом. А. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-lac (pSTH 38+4/P-lac, pSTH 33+3/P-lac, pSTH 35-0/P-lac, pSTH 19-1/P-lac, pSTH 9-2/P-lac, pSTH 12-4/P-lac, pSTH 14-10/P-lac) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322, фрагмент содержащий двойной lac-UV-5-промотор и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов:
плазмидная ДНК вектора рBR 322 за исключением участка размером 35 п.о. между участками расщепления рестриктаз EcoRI и Hind III, размер которой 4331 п.о.;
EcoRI - фрагмент, содержащий двойной lac UV-5-промотор, размером 285 п. о. ЕcoRI-Hind III-фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТС ТАТG, первые 5 нуклеотидов которой являются частью участка расщепления ЕсоRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон АТG, за которым в индивидуальных плазмидах данной серии следуют последовательности, представленные ниже
pSTH 38+4/P-lac - G C T C TC ... pSTH 33+3/P-lac - C T C TC CA ... pSTH 35-O/P-lac - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/P-lac - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-lac - AC AT CC TA TC ... pSTH 12-4/P-lac - CC TA TC AG CT ... pSTH 14-10/P-lac - C C T G C ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера сохранившихся кодонов сигнального пептида прегормона (со знаком + ) или кодонов зрелого гормона. Молекулярная масса гибридных плазмид серии рSTH/P-lac равна 3,4 мд, размер 5300 п.о. Копийность полученных плазмид около 20-30 молекул на клетку. Плазмидные ДНК серии рSTH/P-lac содержат уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз ЕсoRY, BamHI. Hind III, SalGI и Bgl II, по два сайта рестрикции для ферментов EcoRI и Pst I. Это было установлено путем расщепления гибридных плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции и анализа продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.1). В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P-lac входят гены:
SТH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии:
pSTH 38 + 4/P-lac - Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-СТГЧ;
pSTH 33 + 3/Р-lаc - Мет- Гли-Сер-Ала-СТГЧ;
pSTH 35-0/Р-lаc - Мет-СТГЧ;
pSTH 19-1/Р-lаc - Мет-(дез-фен¹)-СТГЧ;
pSTH 9-2/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ;
pSTH 12-4/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ;
pSTH 14-10/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷
-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ. bla - ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы;
tet - ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику тетрациклину штаммов, несущих плазмиды. Репликация рекомбинантных плазмидных ДНК осуществляется за счет репликона плазмиды рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем lac UV-5-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем этого промотора, но с меньшей интенсивностью, чем в исходной плазмиде рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSТН/P-lac к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой питательной среде, 5-7 мл/л в жидкой питательной среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-lac амплифицируются при добавлении в среду хлорамфеникола, неконъюгативны. Б. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-tac (pSTH 35-0/P-tac, pSTH 19-1/P-tac, pSTH 9-2/P-tac, pSTH 12-4/P-tac, pSTH 14-10/P-tac) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322; фрагмент, содержащий гибридный tac-промотор, и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов:
плазмидная ДНК вектора рBR 322 размером 4331 п.о.;
ЕсоRI - фрагмент, содержащий гибридный tac-промотор, размером 276 п.о.;
ЕcoRI-Hind III - фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТСТТАТG, первые 5 нуклеотидов которой являются частью сайта расщепления ЕсоRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон ATG, за которым в индивидуальных плазмидных ДНК данной серии следуют последовательности, представленные ниже:
pSTH 35-O/P-tac - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/0-tac - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-tac - AC AT CC TA TC ... pSTH 12-4/P-tac - CC TA TC AG CT ... pSTH 14-10/P-tac - C C T G C ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера кодонов зрелого СТГЧ. Молекулярная масса гибридных плазмидных ДНК серии рSTH/P-tac равна 3,4 мд, размер 5300 п.р. ДНК плазмид серии рSTH/P-tac содержит уникальные сайты рестрикции EcoRY, BamHI, Hind III, SalGI, Bgl II и по два сайта рестрикции ЕсоRI и Pst I, что установлено путем расщепления плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции и анализа продуктов расщепления с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.2). Из сравнения данных табл.1 и 2 видно, что продукты расщепления плазмидных ДНК рSTH/P-lac и pSTH/P-tac рестриктазами Hind III, BamHI, EcoRV, Bgl II и Pst I неотличимы по подвижности в агаровых гелях. При расщеплении плазмидных ДНК рестриктазой ЕсоRI образуются два фрагмента размером 5000 п. о. и 285 п.о. в случае рSTH/P-lac и 5000 п.о. и 275 п.о. в случае рSTH/P-tac. Из электрофореграммы 8% -ного акриламидного геля видно различие в подвижности меньших фрагментов ЕсоRI-гидролизатов плазмид серий pSTH/P-lac и pSTH/P-tac. В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P-tac входят гены:
STH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии:
pSTH 35-0/Р-tаc - Мет-СТГЧ
pSTH 19-1/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ
pSTH 9-2/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ
pSTH 12-4/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ
pSTH 14-10/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷
-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ
bla - ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы;
tet - ген, обеспечивающий устойчивость штаммов, несущих плазмиды, к тетрациклину. Репликация рекомбинантных плазмид осуществляется за счет репликона рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем tac-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем tac-промотора, но с меньшей эффективностью, чем в случае исходной плазмиды рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSTH/P-tac, к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой среде, 5-7 мг/л в жидкой среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-tac амплифицируются в клетках Е.соli при добавлении в среду хлорамфеникола, неконъюгативны. В. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp, (pSTH 35-0/P-trp, pSTH 19-1/P-trp, pSTH 9-2/P-trp) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322, фрагмент, содержащий trp-промотор (промотор триптофанового оперона Е.coli) и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов:
плазмидная ДНК вектора рBR 322, размер которой 4300 п.о.;
фрагмент ДНК, содержащий trp-промотор Е.сoli, который встроен между геном bla и EcoRI-участком расщепления плазмидной ДНК рBR 322, размером 800 п.о.;
EcoRI - Hind III - фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТСТАТG: первые 5 нуклеотидов которой являются частью сайта расщепления ЕсoRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон АТG, за которым в индивидуальных плазмидных ДНК данной серии следуют последовательности, представленные ниже:
pSTH 35-O/P-trp - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/P-trp - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-trp - AC AT CC TA TC ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера кодонов зрелого СТГЧ. Молекулярная масса гибридных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp равна 3,7 мд, размер 5800 п. о. ДНК-плазмид этой серии содержит уникальные сайты рестрикции EcоRV, BamHI, Hind III, Bgl II и EcoRI и два сайта рестрикции Pst I, что установлено путем расщепления плазмидных ДНК указанными ферментами и анализа продуктов гидролиза с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.3)
В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp входят гены:
STH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии:
pSTH 35-0/Р-trp - Мет-СТГЧ
pSTH 19-1/Р-trp - Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ
pSTH 9-2/Р-trp - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ
bla - ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы;
tet - ген, обеспечивающий устойчивость штаммов, несущих плазмиды к антибиотику тетрациклину. Репликация рекомбинантных плазмид осуществляется за счет репликона плазмиды рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем trp-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем trp-промотора, но с меньшей интенсивностью, чем в исходной плазмиде рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSTH/P-trp к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой питательной среде, 5-7 мг/л в жидкой среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-trp амплифицируются в клетках Е. coli при добавлении в среду культивирования хлорамфеникола, неконъюгативны. II. Сущность способа конструирования предлагаемых плазмидных ДНК, кодирующих синтез производных СТГЧ, состоит в том, что в участок расщепления рестриктазы Hind III плазмидной ДНК рBR 322 вносят ДНК, комплементарную мРНК из аденомы гипофиза человека, продуцирующей повышенное количество СТГЧ, путем гибридизации с меченной кДНК, рестрикционного картирования и определения первичной структуры, отбирают рекомбинантную плазмиду, содержащую вставку ДНК, кодирующую предшественник СТГЧ, названную р-pre-STH-18. Для прямой экспрессии СТГЧ в Е.coli необходимо удалить из полученной рекомбинантной плазмиды р-pre-STH-18 нуклеотидные последовательности, соответствующие 5'-нетранслируемой области и кодирующие сигнальный пептид пре-СТГЧ. С этой целью плазмидную ДНК р-pre-STH-18 расщепляют рестриктазой ЕсоRV и обрабатывают экзонуклеазой III Е.coli и нуклеазой S 1 из Aspergillus orisae. Время инкубации и соотношение ДНК и фермента экзонуклеазы III подбирают таким образом, чтобы в результате было удалено 250-300 нуклеотидов одной цепи от конца фрагмента, поскольку расстояние от ЕсоRV-сайта до 1-го кодона зрелого СТГЧ составляет в плазмиде р-pre-STH-18 269 нуклеотидов. К смеси полученных линейных молекул плазмидной ДНК пришивают синтетический олигонуклеотид, содержащий участок расщепления ЕсoRI и инициирующий кодон АТG, затем после расщепления рестриктазами ЕсоRI и Hind III смесь продуктов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, выделяют фрагменты размером около 700 п.о., сшивают их ДНК лигазой фага Т4 с векторной плазмидой рBR 322, также расщепленной рестриктазами ЕсоRI и Hind III, полученной смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е.coli, отбирают клоны устойчивые к ампицилину, но потерявшие устойчивость к тетрациклину, и анализируют методом рестрикционного картирования плазмидные ДНК, выделенные из клонов. Из полученной коллекции плазмид путем определения нуклеотидной последовательности, прилегающей к ЕсоRI-сайту, отбирают те, в которых искусственный АТG-кодон, происходящий из синтетического линкера, находится в рамке считывания с последовательностью, кодирующей СТГЧ. Таким образом, получают разные варианты укороченного гена СТГЧ, часть из которых более подробно охарактеризована в приведенных в заявке примерах (плазмидные ДНК рSTH). Далее в участок расщепления ЕсоRI, происходящий из синтетического линкера и расположенный непосредственно перед АТG-инициирующим кодоном, встраивают фрагмент ДНК, содержащий бактериальный промотор, такой как двойной lac UV-5-промотор или гибридный tac-промотор, обеспечивающие синтез одного из производных СТГЧ, после введения этих плазмид в клетки E.coli. Для получения плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp плазмидные ДНК серии pSTH гидролизуют рестриктазами BamHI и EcoRI, выделяют фрагмент размером 1050 п. о. и встраивают его по тем же сайтам в плазмиду рВР-trp, содержащую trp-промотор. Штаммы - продуценты производных СТГЧ - получают трансформацией клеток Е. coli K 802 одной из предложенных рекомбинантных плазмидных ДНК. Уровень синтеза производных СТГЧ в сконструированных штаммах составляет при плотности культуры 4х10⁸ 2-2,5 мг/л в случае плазмид серии рSTH/P-lac (pSTH 19-1/P-lac), 4-6 мг/л в случае плазмид серии pSTH/P-tac (pSTH 19-1/P-tac), 7-8 мг/л в случае плазмид серии рSTH/P-trp (pSTH 19-1/P-trp). Все штаммы Е.coli К 802, содержащие рекомбинантные плазмидные ДНК одной из предложенных серий, характеризуются следующими общими признаками. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. При росте на питательном агаре Дифко колонии гладкие, круглые, блестящие, серые, края колоний ровные. При росте в жидких средах УТ LB образуют ровную интенсивную муть. Физико-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^оС, оптимум рН 6,8 - 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной форме, так и органические в виде пептона, триптона, аминокислот. Устойчивость к антибиотикам. Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды. Проявляют устойчивость к тетрациклину, 20 мг/л на агаре, 5-7 мг/л в жидкой среде. Предложенные штаммы содержат плазмидные ДНК серий рSTH/P-lac, pSTH/P-tac или рSTH/P-trp. Присутствие в штаммах плазмидных ДНК подтверждается путем проверки их устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК одним из известных методов. Штаммы депонированы во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под следующими номерами. 1. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 38+4/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, под номером ВКМ R13-D. 2. Штам Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 33+3/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, под номером ВКМ R14-D. 3. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R15-D. 4. Штамм Е. соli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 19-1/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R16-D. 5. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК pSTH 9-2/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R17-D. 6. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 12-4/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ, под номером ВКМ R18-D. 7. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 14-10/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)- СТГЧ, под
номером ВКМ R19-D. 8. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R20-D. 9. Штамм Е.coli 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 19-1/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R21-D. 10. Штамм Е.соli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 9-2/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R22-D. 11. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 12-4/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ, под номером ВКМ R23-D. 12. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 14-10/3-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)- СТГЧ, под
номером ВКМ R24-D. 13. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R25-D. 14. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК pSTH 19-2/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R26-D. 15. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 9-2/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R27-D. Способы получения рекомбинантных плазмидных ДНК серий рSTH/P-lac, pSTH/P-tac и pSTH/P-trp иллюстрируются следующими примерами. П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH. А. Конструирование плазмидной ДНК р-pre-STH-18, содержащей полную копию кДНК СТГЧ. Выделение поли(А)-РНК из аденомы гипофиза человека. 800 мг аденомы гипофиза, удаленной во время операции, разбивают на кусочки в замороженном состоянии и без предварительного оттаивания разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера в течение 3 мин (скорость вращения пестика составляет 1200 об/мин) в 10 мл 4 М гуанидитиоцианата, содержащего 0,5% лаурилсаркозина натрия, 0,25 мМ цитрата натрия, рН 7,0, 0,1 М меркаптоэтанола, 0,1% пеногасителя (Antifoam A,Сигма) при комнатной температуре. В три пробирки от ротора SW 50,1 (Бекман) вносят по 1,2 мл 5,7 М раствора хлористого цезия (плотность 1,709), забуференного ацетатом натрия, рН 7,0, и отстерилизованного 0,2% -ным раствором диэтилпирокарбоната. Затем в каждую пробирку осторожно насливают полученный гомогенат и центрифугируют при 36 000 об/мин (120000 G) 12 ч при 20^оС. Осадок РНК растворяют в 0,2 мл 0,2 М хлористого натрия и переосаждают два раза этанолом. Осадок растворяют в 0,5 мл 1 мМ ЭДТА, рН 7,0, и измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм. Далее раствор РНК прогревают 5 мин при 70^оС, быстро охлаждают и добавляют к нему до концентрации 0,5 М, 10 мМ и 0,2%-ной хлористый натрий, трис-НСl, рН 7,5, и додецилсульфат натрия соответственно. 1 мл такого раствора наносят на колонку олиго(dT)-целлюлозы. 20 мг олиго(dT)-целлюлозы Т-7 (Р-L Biochemicals, Inc., США) замачивают в дистиллированной воде для набухания в течение 1 ч. Полученной суспензией заполняют колонку, приготовленную из наконечника для автоматической пипетки объемом 1 мл. Объем олиго(dT)-целлюлозы в колонке составляет 100 мкл. Колонку промывают 0,5 мл 0,1 н. NaOH, отмывают водой до рН 7,0 и уравновешивают, пропуская через нее 30 объемов (3 мл) буферного раствора 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 0,2% SDS. Далее на колонку наносят препарат РНК в 1 мл буфера того же состава, промывают ее 2 мл того же буфера. Поли(А)-РНК элюируют 10 мМ трис-НСl буфером, рН 7,5, содержащим 0,2% SDS. Собирают 250 мл элюата. Скорость попротока буфера при уравновешивании колонки, нанесении образца, промывке и элюции составляет 3 мл в 1 ч. Фракции с поли(А)-РНК переосаждают дважды этанолом и хранят под этанолом при -20^оС. Для анализа препаратов поли(А)-РНК используют электрофорез в кислых денатурирующих агарозных гелях следующего состава: 1,6% агароза, 6 М мочевина, 0,025 М ацетат натрия, рН 5,0. Перед нанесением на гель высушенные образцы РНК растворяют в растворе 0,025% бромфенолового синего, 7 М мочевины, 20% сахарозы, 0,025 М цитрата натрия. Синтез двухцепочечной кДНК (дцк ДНК). Синтез дцкДНК осуществляют по методу, описанному Seeburg P.et al. Nature, 1977, 270, N 8, р.486-494. В качестве матрицы для обратной транскриптазы используют поли(А)-РНК, выделенную из аденомы гипофиза человека. Затравкой служит олиго(dT) 12-18 фирмы "Р-L Biochemicals, Inc. ", США. Реакцию проводят в 100 мкл инкубационной смеси следующего состава: 70 нг поли(А)-РНК, 200 мкг/мл олиго(dT) 12-18, 50 мМ трис-НСl, рН 8,1, 20 мМ хлористого калия, 7 мМ хлористого натрия, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 500 мкМ dАТР, dGTP, dTTP, 50 мкМ, dСТР, 1,25 мкМ (α-³²Р)-dСТР (50 мкКи), 5 ед. (4 мкл) обратной транскриптазы. После инкубации в течение 2 ч при 42^оС реакцию останавливают добавлением ЭДТА, рН 8,0, до конечной концентрации 10 мМ, затем проводят экстрацию равным объемом фенола, насыщенного ТЕ-буфером, и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Осадок растворяют в 30 мкл 5 мМ трис-НСl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом G-50. Колонку с сефадексом G-50 (Superfine, Farmacia) объемом 1,8 мл (h=10 см, s = 0,17 см²) уравновешивают 5 объемами буфера следующего состава: 5 мМ трис-НСl, рН 7,5, 1 мм ЭДТА. Гель-фильтрацию проводят в том же буфере. Скорость нанесения препарата и элюции 0,4 мл/ч. К фракциям кДНК (200 мкл) добавляют 1 мкл тРНК-носителя (1 мг/мл) и 3 объема этанола, охлаждают 10 мин при -70^оС. кДНК осаждают центрифугированием (10000G, 10 мин). Осадок промывают этанолом и растворяют в 50 мкл 0,1 н. NaOH, 1 мМ ЭДТА. Полученный раствор прогревают 20 мин при 70^оС для деградации РНК, затем нейтрализуют 0,1 н. соляной кислотой и снова переосаждают этанолом. После предварительной денатурации одноцепочечной ДНК проводят достройку второй цепи в полимеразном буфере в присутствии всех четырех dNТР в концентрации 400 мкМ и 5 единиц (2 мкл) ДНК-полимеразы 1 E. coli 2 ч при 40^оС. После реакции смесь экстрагируют 2 объемами фенола и кДНК осаждают этанолом. Осадок растворяют в 30 мкл 5 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТа и фракционируют на колонке с сефадексом G-50, как описано выше. Фракции, содержащие двухцепочечную кДНК, осаждают спиртом. Обработку нуклеазой S1 проводят в инкубационной смеси, содержащей 300 мМ хлористого натрия, 30 мМ ацетата натрия, рН 4,5, 3 мМ хлористого цинка, в присутствии 5 ед. фермента (1 мкл) 10 мин при 37^оС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ, после чего ДНК осаждают этанолом. Достройку ДНК до образования "тупых" концов проводят 2 ед. (1 мкл) ДНК-полимеразы 1 E.coli в течение 10 мин при 10^оС в 25 мкл следующей инкубационной смеси: 200 мкМ каждого dNTP, 60 мМ трис-НСl, рН 7,5, 8 мМ хлористого магния, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ АТР. Фосфорилирование и присоединение синтетических линкеров и фракционирование кДНК. Фосфорилирование 200 пмолей линкера проводят в следующей инкубационной смеси: 50 мМ трис-НСl, рН 9,0, 10 мМ хлористого магния, 5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мМ АТР в приcутcтвии 5 ед. (2 мкл) полинуклеотидкиназы фага Т4 и 20-50 мкКи (γ-³²Р)-АТР в течение 30 мин при 37^оС. Далее добавляют АТР до конечной концентрации 0,5 мМ, 10 ед. (4 мкл) киназы и инкубируют еще 30 мин. Фосфорилированный линкер отделяют от АТР на колонке с сефадексом G-50. Для приготовления сефадекса G-50 и гель-фильтрации используют дистиллированную воду. Объем колонки составляет 1 мл, скорость нанесения препарата и элюции 2,4 мл/ч. Фракции анализируют электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной с последующей авторадиографией геля. Нужные фракции объединяют и лиофилизируют. 50 пмоль линкера растворяют в 15 мкл буфера для ДНК-полимеразы 1 и добавляют к препарату кДНК. Лигирование проводят в присутствии 50 ед. (1 мкл) ДНК-лигазы фага Т4 12 ч при 15^оС. После этого добавляют 100 мкл буфера: 6 мМ хлористого магния, 60 мМ хлористого магния, 60 мМ β-меркаптоэтанола, нагревают 5 мин при 80^оС и охлаждают. К реакционной смеси добавляют 20 ед. (2 мкл) рестриктазы Hind III и инкубируют 3 ч при 37^оС. Полноту лигирования и расщепления рестриктазой проверяют электрофорезом в 8- и 20% ПААГ с последующей авторадиографией. Нужные для клонирования фракции ДНК (размером 750-850 н.п.) получают путем элюции из препаративного 5% ПААГ. Приготовление ПААГ, электрофорез и выделение фрагментов ДНК проводят по следующей методике. Гель приготовляют из концентрированных запасных растворов акриламида : бисакриламида (30: 1), 20-кратного буфера (1 М трис-НСl, борная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3), воды, катализатора и инициатора полимеризации. Раствор без инициатора полимеризации фильтруют через хроматографическую бумагу (ватман 3 мм), затем дегазируют, после чего добавляют инициатор полимеризации (ТЭМЭД) и быстро вливают в форму. Количество катализатора (персульфат аммония) составляет 1 мг/мл, а ТЭМЭД добавляют из такого расчета, чтобы полимеризация заканчивалась через 10 мин после заливки формы. Концентрация мономера составляет 5%. До нанесения образцов гель подвергают преэлектрофорезу в течение 1 ч при напряжении 70% от рабочего. Электрофорез проводят при токе 30 мМ. Об окончании разделения препаратов ДНК судят по миграции маркерных красок. Локализацию кДНК в геле определяют путем радиоавтографии. Далее вырезают из геля полосу, соответствующую фрагментам ДНК размером 750-850 п. о. Для элюции ДНК кусочек геля измельчают растиранием в сухой пробирке стеклянной палочкой, добавляют 10 мкг тРНК-носителя, два объема элюирующего буфера: 125 мМ хлористого натрия, 25 мМ трис-НСl, рН 7,5,6 мМ ЭДТА, и инкубируют в течение ночи при 37^оС. Суспензию геля центрифугируют при 4000 об/мин (1800 G) 5 мин и супернатант фильтруют через стекловату. Гель промывают 1 объемом буфера, снова центрифугируют и супернатант фильтруют. К полученному элюату при комнатной температуре добавляют по каплям 1% -ный раствор цетавлона (цетилтриметиламмоний бромистый) до конечной концентрации 0,1%. Смесь оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем помещают в холодильник на 30 мин. Раствор центрифугируют при 10000 G 10 мин при 4^оС и супернатант сливают. Осадок ДНК растворяют в 3 М ацетате натрия, рН 6,0, добавляют три объема этанола и охлаждают в бане сухого льда с этанолом (-70^оС) 10 мин. Затем центрифугируют 10 мин при 10000 G и при -20^оС. Осадок растворяют в 0,3 М ацетате натрия до рН 6,0, переосаждают еще раз, промывают 96%-ным этанолом и высушивают. Клонирование кДНК в векторной плазмиде рВR 322. 2 мкг плазмидной ДНК рВR 322 гидролизуют рестриктазой Hind III в инкубационной смеси объемом 50 мкл, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 2 ед. (2 мкл) рестриктазы Hind III, в течение 1 ч при 37^оС. Затем проводят двукратную экстракцию равным объемом фенола, насыщенного ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), двукратную экстракцию равным объемом хлороформа и плазмидную ДНК осаждают спиртом. Далее плазмиду обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой (1 мкг фермента на 1 мкг плазмиды) в 100 мМ трис-НСl, рН 8,0, при 65^оС в течение 30 мин. Смесь экстрагируют фенолом два раза, хлороформом два раза и ДНК переосаждают спиртом. 1 мкл раствора плазмидной ДНК (0,1 мкг) смешивают с 5 мкл раствора кДНК с пришитым Hind III - линкером и лигируют полинуклеотидлигазой фага Т4 в 20 кмл инкубационной смеси, содержащей 1 мМ АТР, 20 мМ трис НСl, рН 7,5, 10 мМ дитиотрейтола, 10 мМ хлористого магния и 20 ед. (1 мкл) лигазы, 1-2 ч при 15^оС. Далее инкубационную смесь используют непосредственно для трансформации клеток Е.coli. Для трансформации бактериальных клеток 50 мл УТ-среды заражают 1 мл ночной культуры клеток штамма Е.coli НВ 101 и выращивают на качалке при 37^оС до плотности 0,6 при 550 нм. Клетки собирают центрифугированием на холоде при 10000 об/мин (8500 G) в течение 10 мин. Осадок суспендируют в 25 мл холодного раствора 50 мМ хлористого кальция и выдерживают во льду 30 мин. Последующие операции проводят также в ледяной бане. Затем клетки снова осаждают в том же режиме и суспендируют в 2,5 мл того же раствора и оставляют на 30 мин. Лигазную смесь в объеме 100 мкл добавляют к 200 мкл полученной суспензии клеток и выдерживают 20 мин во льду, затем 2 мин при 42^оС, после чего 10 мин при комнатной температуре. К каждой пробе добавляют 2 мл свежей УТ-среды и подращивают клетки 1 ч на качалке при 37^оС. Клетки из исходной пробирки и из пробирок с разведением 1:10 и 1:100 высевают на чашки с УТ-агаром (5 г дрожжевого экстракта, 8 г бактетриптона, 5 г NaCl, 15 г бактоагара на 1 л среды) и антибиотиком (20 мг ампициллина на 1 л) по 0,5 мл на чашку. Колонии на чашках вырастают через 14-20 ч при 37^оС. Анализ рекомбинантных плазмид. В качестве первого этапа отбора рекомбинантных клонов используют гибридизацию колоний с ³²Р-меченой кДНК из аденомы гипофиза, синтезированной, как описано ранее. Нитроцеллюлозный фильтр накладывают на поверхность агара с выросшими на нем колониями, через 5 мин фильтр снимают и переносят на стерильную чашку с УТ-агаром, содержащим ампициллин, и подращивают 12-14 ч при 37^оС. Фильтр аккуратно помещают на поверхность 0,5 н. раствора едкого натра на 7 мин так, чтобы не залить поверхность фильтра с колониями. После удаления щелочи фильтр помещают последовательно на поверхности раствора 1 М трис-НСl, рН 7,4, на 5 мин и 1,5 М хлористого натрия, 0,5 трис-HCl, рН 7,4, на 5 мин. Все последующие растворы наслаиваются на поверхность фильтра. Высушенный фильтр помещают в раствор проназы Р (Серва) с концентрацией 2 мг/мл в 1хSSC буфере (0,15 М хлористый натрий, 0,015 М цитрат натрия) на 15 мин. Затем фильтр подсушивают и 2 раза промывают хлороформом, сушат и на 5 мин погружают в раствор 0,3 М хлористого натрия, после чего сушат в вакуумном шкафу 2 ч при 80^оС. Гибридизация. Фильтр помещают для предгибридизации в следующий раствор: 10 х раствор Денхардта (0,2% фикол, 0,2% поливинилпирролидон, 0,2% бычий сывороточный альбумин), 1 М хлористый натрий, 50 мМ трис-НСl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1% додецилсульфат натрия, 10 мкг/мл полиадениловой кислоты, 10 мкг/мл ДНК тимуса теленка фирмы "Сигма" (США) и выдерживают 12 ч при 60^оС. Далее фильтр промывают в 1хSSC, подсушивают и наносят на него меченую пробу после ее предварительной денатурации в кипящей водяной бане (5 мин). Фильтр заливают вазелиновым маслом и инкубируют 12 ч при 60^оС. Затем фильтр отмывают три раза хлороформом, а далее раствором 2хSSC с 0,2% додецилсульфата натрия при 60^оС до тех пор, пока уровень радиоактивности не становится постоянным. После отмывки фильтр сушат и радиоавтографируют. Из авторадиограммы видно, что целый ряд колоний дают сильную гибридизацию с радиоактивной пробой. Следующим этапом рекомбинантных клонов является рестрикционный анализ выделенных из них плазмидных ДНК. Для анализа большого числа клонов используют метод быстрого выделения плазмидных ДНК, который заключается в следующем. Клетки из 3 мл ночной культуры осаждают в настольной центрифуге Эппендорф при 10000хG 2 мин. Осадок клеток суспендируют в 100 мкл раствора 1:2 мг/мл лизоцима, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-НСl, рН 8,0. Пробирки помещают в лед на 30 мин. Последующие операции также проводят во льду. Далее добавляют 200 мкл раствора 2:0,2 н. гидроокись натрия, 1% додецилсульфата натрия, и хорошо перемешивают. Через 5 мин добавляют 150 мкл 3 М раствора ацетата натрия, рН 4,8, перемешивают и оставляют на 1 ч. Затем раствор центрифугируют 5 мин при 10000хG. Из супернатанта плазмиду осаждают спиртом и растворяют в 50 мкл воды. Таким образом выделяют 5 мкг плазмиды. Далее выделенные плазмиды анализируют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле без предварительного расщепления и после гидролиза рестриктазами Hind III или Hind III + Bgl II. Обработку рестриктазами проводят в стандартных условиях. Гидролиз рестриктазой Hind III проводят в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 0,5 мкг (5 мкл) плазмидной ДНК, 2 ед. (2 мкл) рестриктазы Hind III, 1 мкл раствора РНКазы (10 мг/мл). Температура инкубации 37^оС, время инкубации 1 ч. Двойной гидролиз рестриктазами Hind III и Bgl 11 проводят в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис НСl, рН 7,5, MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 0,5 мкг (5 мкл) плазмидной ДНК, 2 мкл (2 ед.) рестриктазы Hind III, 2 мкл (2 ед.) рестриктазы Bgl II и 1 мкл раствора РНКазы (10 мг/мл). Смесь инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Для приготовления геля навеску агарозы (Сигма) добавляют к трис-ацетатному буферу (0,04 М трис-HCl, 0,02 М ацетат натрия, 0,001 М ЭДТА, рН 7,6) и нагревают до кипения на газовой горелке, затем охлаждают приблизительно до 70^оС. После этого вливают в форму, представляющую собой два стекла 20х20 см, разделенных по краям двумя плексиглазовыми или тефлоновыми прокладками толщиной 1,5 мм, снизу помещают прокладку из хроматографической бумаги (ватман 3 мм). После заполнения формы в нее вставляют "гребенку" и оставляют в горизонтальном положении до затвердевания геля. Затем вынимают "гребенку", ячейки промывают тем же буфером и помещают в прибор для электрофореза. Образцы, которые наносят на гель, содержат 10% глицерин и 0,005% маркерные краски: бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол голубой (ХС). Электрофорез проводят при постоянном напряжении 120-150 В при токе 30-40 мА в течение 3-4 ч. В 1%-ном агарозном геле с ВРВ движутся фрагменты ДНК длиной 600 нуклеотидных пар, а с ХС - около 2500. После окончания электрофореза верхнее стекло с геля снимают и гель погружают в раствор бромистого этидия (1 мкг/мл) на 10 мин, споласкивают водой и фотографируют в ультрафиолетовом свете через оранжевый светофильтр. По данным рестрикционного анализа отбирают плазмидные ДНК, содержащие вставки размером 800 п.о., вырезаемые в результате гидролиза рестриктазой Hind III и имеющие участок расщепления рестриктазами Bgl II. Для окончательного отбора плазмидных ДНК, содержащих полноразмерную копию кДНК СТГЧ проводят анализ первичной структуры вставок. Последовательность вставок из двух плазмид p-pre STH-17 и p-pre STH-18, полученных, как описано в примере 1, совпадает с определенной ранее нуклеотидной последовательностью кДНК СТГЧ. Конструирование плазмидных ДНК серии рSТН, содержащих делеционные варианты кДНК СТГЧ. Плазмидную ДНК p-pre STН-18 гидролизуют рестриктазой EcoRV. Гидролиз плазмидной ДНК рестриктазой EcoRV проводят в 40 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 10 мкг (20 мкл) плазмидной ДНК p-pre STH-18, 4 мкл (40 ед.) рестриктазы EcoRV, в течение 1 ч при 37^оС. Затем обрабатывают линейную форму плазмиды эндонуклеазой III E.coli при 22^оС в инкубационной смеси следующего состава: 60 мМ хлористого натрия, 6,6 мМ трис-НСl, рН 7,4, 6,6 мМ хлористого магния, 6,6 мМ β-меркаптоэтанола. На 10 мкг плазмиды берут 140 ед. (2 мкл) фермента и инкубируют в течение 10 и 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 5-кратного S I х буфера: 300 мМ хлористого натрия, 30 мМ ацетата натрия, рН 4,5, 3 мМ хлористого цинка, добавляют 8 ед. (2 мкл) нуклеазы S I и инкубируют в течение 1 ч 40 мин при 22^оС. Далее проводят обработку 3 ед. (1 мкл) ДНК-полимеразы I E.coli, как описано в примере 1А, с целью получения тупых концов. К смеси добавляют фосфорилированный описанным в примере 1А методом синтетический олигонуклеотид, имеющий структуру 5'-CATAGAATTCTATG-3', и проводят обработку 50 ед. (1 мкл) ДНК-лизагы фага Т4. После инактивации лигазы (65^оС, 5 мин) проводят гидролиз в стандартных условиях рестриктазами EcoRI для генерации "липких" ЕcoRI-концов и Hind III для отщепления фрагментов кДНК от векторной плазмиды pBR 322. Полученную смесь фракционируют электрофорезом в 5% ПААГ и элюируют фрагменты, имеющие длину 600-800 нуклеотидных пар, поскольку расстояние от Hind III-сайта до 1-го кодона зрелого СТГЧ в p-pre SТН-18 составляет 701 н. п. Элюированные фрагменты после переосаждения цетавлоном и спиртом используют для клонирования в векторной плазмиде рBR 322, гидролизованный рестриктазами EcoRI и Hind III. После трансформации клеток штамма Е.coli НВ 101 отбирают клоны с фенотипом Ар^RTc^S. Из клонов выделяют плазмидные ДНК и электрофоретически анализируют размер фрагментов, образуемых при их совместном гидролизе рестриктазами Pst I и EcoRI. Отбирают плазмиды, в которых размер фрагмента составляет 130-150 н.п. Проанализировано 200 клонов и отобрано 45 клонов, содержащих плазмидные ДНК с подходящим размером делеции перед кодирующей частью гена СТГЧ. Далее проводят анализ первичной структуры плазмидных ДНК в участке, прилегающем к EcoRI-сайту. Для дальнейшей работы отбирают плазмидные ДНК, в которых АТG-кодон, происходящий из встроенного синтетического олигонуклеотида, находится в рамке считывания с последовательностью, кодирующей СТГЧ плазмидные ДНК: рSTH 38+4, рSTH 33+3, pSTH 35-0, pSTH 19-1, pSTH 9-2, pSTH 12-4 и pSTH 14-0. П р и м е р 2. Конструирование плазмидных ДНК серии pSTH/P-lac. Плазмидную ДНК pLJ3 гидролизуют рестриктазой ЕcоRI в стандартных условиях. Продукты гидролиза фракционируют с помощью электрофореза в 8% ПААГ. Гель окрашивают бромистым этидием и вырезают полосу, содержащую фрагмент ДНК размером 285 н.п. (lac UV-5-промоторный фрагмент). Плазмидную ДНК рSTH 19-1 гидролизуют рестриктазой ЕсоRI в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 100 мМ NaCl, 50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 10 мкг (20 мкл) плазмидной ДНК, 3 мкл (30 ед.) рестриктазы ЕсоRI в течение 2 ч при 37^оС. Далее обрабатывают щелочной фосфатазой, как описано в примере 1. После экстракции смеси фенолом (дважды) и хлороформом (дважды) плазмидную ДНК осаждают спиртом. Осадок ДНК растворяют в лигазном буфере: 66 мМ трис-НCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ, добавляют ДНК фрагмента длиной 285 н.п., выделенного из плазмиды рLJ3, и лигазу фага Т4. В опыт берут 0,1 мкг плазмидной ДНК, 0,1 мкг фрагмента, 1 ед. активности лигазы (1 мкл), инкубацию проводят в 50 мкл при 14^оС. После инкубации с лигазой реакционную смесь используют для трансформации клеток штамма Е.coli К 802 по методу, описанному в примере 1. Отбор клонов, содержащих плазмиды со встроенными lac UV-5-промотором, проводят на минимальной питательной среде с 1,5%-ным агаром, содержащей X-gal. Отбирают клетки, образующие на индикаторной среде голубые колонии. Для отбора из них клонов, несущих плазмиды с lac UV-5-промотором, встроенном в нужной ориентации, клетки перекалывают на чашки с УТ-агаром, содержащим ампициллин и тетрациклин (в случае ориентации промотора в нужном направлении происходит экспрессия гена, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину). Из клеток Т_с^R клонов выделяют плазмидные ДНК и дополнительно проверяют ориентацию промоторного фрагмента, гидролизуя их рестриктазой Bsp 1 в 15 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 0,5 мкг (5 мкл) плазмидной ДНК, 2 мкл (2 ед. рестриктазы Bsp 1 и 1 мкл РНКазы (10 мкг/мкл), в течение 2 ч при 37^оС, и анализируя продукты гидролиза электрофорезом в 8%-ном ПААГ. Используя в качестве исходного материала различные плазмидные ДНК серии рSTH 38+4, pSTH 33+3, pSTH 35-0, pSTH 19-1, pSTH 9-2, pSTH 12-4, pSTH 14-10), по описанной в данном примере схеме конструируют плазмидные ДНК серии pSTH/P-lac: pSTH 38+4/P-lac, pSTH 33+3/P-lac, pSTH 35-0/P-lac, pSTH 19-1/P-lac, pSTH 9-2/P-lac, pSTH 12-4/P-lac, pSTH 14-10/P-lac. П р и м е р 3. Конструирование плазмидных ДНК серии pSTH/P-tac. Конструирование плазмидных ДНК серии pSTH/P-tac проводят по схеме, аналогичной той, которую используют в предыдущем примере. ЕсоRI-фрагмент размером 275 н.п., выделенный из плазмидной ДНК рВР-tac, содержащий гибридный tac-промотор Е.coli, сшивают ДНК-лигазой фага Т4 с плазмидным ДНК серии рSTH, гидролизованными рестриктазой ЕсоRI и обработанными щелочной фосфатазой. Реакцию лигирования, трансформацию бактерий и отбор клонов проводят, как описано в примере 2. Используя в качестве исходного материала плазмидные ДНК серии рSTH-pSTH 35-0, pSTH 19-1, pSTH 9-2, pSTH-12-4, pSTH 14-10, по описанной в данном примере схеме конструируют плазмидные ДНК pSTH 35-0/P-tac, pSTH 19-1/P-tac, pSTH 9-2/P-tac, pSTH 12-4/P-tac, pSTH 14-10/P-tac соответственно. П р и м е р 4. Конструирование плазмидных ДНК серии pSTH/P-trp. Используют методики, описанные в предыдущих примерах. Плазмидную ДНК pSTH гидролизуют совместным действием рестриктаз ЕсоRI и BamHI. Продукты гидролиза разделяют электрофорезом в 8% геле и элюируют фрагмент размером 1050 н.п., содержащий ген гормона роста человека. Плазмидную ДНК р-BR-trp, содержащую trp-промотор, Е.coli; гидролизуют рестриктазами ЕсоRI и BamHI и обрабатывают щелочной фосфатазой. К смеси после удаления ферментов экстракцией фенолом и хлороформом и переосаждения спиртом добавляют выделенный из геля фрагмент плазмидной ДНК рSTH и проводят обработку ДНК-лигазой фага Т4. Инкубационную смесь используют для трансформации клеток штамма Е.coli К 802. Из клеток трансформантов выделяют плазмидные ДНК, и анализируют продукты их гидролиза рестриктазами EcoRI и BamHI с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. По данным рестрикционного анализа отбирают клоны, содержащие плазмидные ДНК со встроенным по сайтам BamHI и EcoRI фрагментом размером 1050 п.о. Используя в качестве исходного материала плазмидные ДНК серии pSTH: pSTH 35-0, pSTH 19-1, pSTH 9-2, по описанной в данном примере схеме конструируют плазмидные ДНК pSTH 35-0/P-trp, pSTH 19-1/P-trp и pSTH 9-2/P-trp соответственно. П р и м е р 5. Получение штаммов Е.coli К 802, содержащих рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-lac,-продуцентов производных СТГЧ. 100 мкл раствора плазмидной ДНК серии рSTH/P-lac с концентрацией 10 кмг/мл используют для трансформации клеток штамма Е.coli К 802, описано в примере 1. Трансформанты высевают на чашки с УТ-агаром, содержащим 20 мг/л тетрациклина и 20 мг/л ампициллина. На 1 мкг плазмидной ДНК получают 10⁶-10⁷ трансформантов. Для анализа клонов клетки из отдельных колоний выращивают в течение ночи в 3 мл УТ-среды, выделяют плазмидные ДНК. Плазмидные ДНК анализируют путем расщепления эндонуклеазами рестрикции ЕсоRI, Hind III, BamHI, Pst I, Bgl II, EcoRV и разделения продуктов гидролиза в 1%-ном агарозном геле. Используя для трансформации клеток Е.соli К 802 плазмидные ДНК рSTH 38+4/P-lac, pSTH 33+3/P-lac, pSTH 35-0/P-lac, pSTH 19-1/P-lac, pSTH 9-2/P-lac, pSTH 12-4/P-lac, pSTH 14-10/P-lac, получают штаммы-продуценты Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, Мет-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, Мет-СТГЧ, (дез-Фен¹)-СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ и Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ соответственно, депонированные во Всесоюзной коллекции микроорганизов ИБФМ АН СССР под номерами ВКМ R13-D, ВКМ R14-D, BKM R15-D, ВКМ R16-D, BKM R17-D, BKM R18-D и ВКМ R-19D. П р и м е р 6. Получение штаммов Е.coli К 802, содержащих рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-tac, продуцентов производных СТГЧ. Трансформацию клеток Е.coli K 802 рекомбинантными ДНК серии рSTH/P-tac, отбор трансформантов, выделение плазмидных ДНК и их анализ проводят, как описано в примере 5 для плазмидных ДНК серии рSTH/P-lac. Используя для трансформации клеток Е.coli К 802 рекомбинантные плазмидные ДНК рSTH 35-0/P-tac, рSTH 19-1/P-tac, pSTH 9-2/P-tac, pSTH 12-4/P-tac, pSTH 14-10/P-tac, получают штаммы-продуценты Мет-СТГЧ, (дез-Фен²)-СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)- СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ соответственно, депонированные во Всесоюзной Коллекции микроорганизмов под номерами ВКМ R20-D, BKM R21-D, BKM R22-D, BKM R23-D и ВКМ R24-D. П р и м е р 7. Получение штаммов Е.coli К 802, содержащих рекомбинантные плазмидные ДНК серии pSTH/P-trp, продуцентов производных СТГЧ. Трансформацию клеток Е.coli К 802 рекомбинантными плазмидными ДНК серии рSTH/P-trp, отбор трансформантов, выделение плазмидных ДНК и их анализ проводят, как описано в примере 5 для плазмидных ДНК серии рSTH/P-lac. Используя для трансформации клеток Е.coli К 802 рекомбинантные плазмидные ДНК рSTH 35-0/P-trp, pSTH 19-1/P-trp, pSTH 9-2/P-trp, получают штаммы-продуценты Мет-СТГЧ, (дез-Фен¹)-СТГЧ, Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ соответственно, депонированные во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номерами ВКМ R25-D, BKM R26-D и ВКМ R27-D. П р и м е р 8. Тестирование производных СТГЧ в лизатах клеток штаммов-продуцентов. Клетки штаммов-продуцентов производных СТГЧ выращивают в 100 мл жидкой питательной среде до оптической плотности 1 ед. при 550 нм. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин (8500 G) в течение 10 мин. Лизис клеток осуществляют следующим образом. Клетки, полученные из 10 мл культуры, суспендируют в 2,2 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НСl, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА, 15% сахарозы, 1 мг/мл лизоцима, 0,025% додецилсульфата лития. После инкубации при 0^оС в течение 90 мин добавляют 400 мкл раствора, содержащего 150 мМ трис-НСl, рН 7,5, 280 мМ MgCl₂, 4 мМ СаСl₂, 1 мгк/мл ДНКазы 1. Смесь центрифугируют 15 мин при 120000 G. Супернатант используют для определения содержания гормона. Производные СТГЧ выявляют в лизате методом двойной радиальной иммунодиффузии. П р и м е р 9. Выделение (дез-Фен1)-СТГЧ из биомассы штамма Е.coli К 802, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 19-1/P-trp. Бактериальную культуру штамма Е. coli К 802, несущего плазмидную ДНК pSTH 19-1/P-trp, выращивают на УТ-среде, содержащей 5 мг/л тетрациклина и 20 мг/л ампициллина, в лабораторном ферментере МФ-14 (10 л) до оптической плотности при 550 нм 2-3. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин (12000 G) 10 мин и суспендируют в 1/50 первоначального объема в следующем буфере: 30 мМ фосфат калия, рН 7,0, 50 мМ хлористого натрия. Клетки лизируют озвучиванием на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц в течение 10 мин с перерывами в ледяной бане. Температура суспензии при озвучивании не должна подниматься выше +5^оС. К полученному лизату добавляют по каплям при перемешивании в ледяной бане 5%-ный раствор полиэтиленимина (полимин Р), рН 8,0, до конечной концентрации 0,2%, после чего суспензию перемешивают еще 30 мин и центрифугируют при 27000 об/мин (105000хG) 1,5 ч в роторе Ti-30 (Бекман). К супернатанту добавляют при перемешивании в ледяной бане сухой сульфат аммония до 60% насыщения из расчета 36,1 г на 100 мл раствора, перемешивают еще 30 мин, центрифугируют при 12000 об/мин (20000 G) и растворяют в нужном буфере. Очистку (дез-Фен¹)-СТГЧ проводят, используя ионообменную хроматографию на колонках с ДЕ-32 и КМ-32 и гельфильтрацию на колонке с сефадексом G-100. Сульфатаммониевый осадок растворяют в 10 мМ Na-карбонатном буфере, рН 10,0, и наносят на колонку с ДЕ-32 (V=70 мл, h = 8 см, S = 9 см²), уравновешенную тем же буфером. Гормон элюируют 0,12 н. NaOH. Скорость нанесения препарата, промывки и элюации составляет 66 мл/ч. Фракции, содержащие гормон, нейтрализуют и добавляют к ним сульфат аммония до 60%-ного насыщения (36,1 г на 100 мл) при перемешивании на холоду. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 G и растворяют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,2, и наносят на колонку КМ-32 (V = 50 мл, h=12,5 см, S = 4 см²), уравновешенную тем же буфером. Скорость нанесения образца составляет 30 мл/ч. Гормон в этих условиях не связывается с ионообменником. Фракции, содержащие гормон, объединяют, добавляют к ним сульфат аммония до 60% насыщения (36,1 г на 100 мл) при перемешивании на холоде. Осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, 0,5 М NaCl. Образец наносят на колонку с сефадексом G-100 (V=145 мл, h = 44 см, S = 3,2 см²) в 10 мМ К-фосфатном буфере, 0,5 М NaCl со скоростью 25 мл/ч. Фракции, содержащие гормон, объединяют. Гормон осаждают при 60% насыщении сульфата аммония, как описано выше. Очищенный из клеток Е.coli К 802, трансформированных плазмидной ДНК, рSTH 19-1/P-trp (дез-Фен¹)-СТГЧ идентичен природному СТГЧ по антигенным детерминанатам, что показано методом двойной радиальной иммунодиффузии в агаре. Кроме того, проверка выделенного из бактериальных клеток гормона, проведенная с помощью стандартного тибиа-теста на Каунасском заводе эндокринных препаратов Минмедпрома СССР показала, что его биологическая активность составляет 1,5 ед/мг, что не уступает активности фармацевтических препаратов гормона, выделенных из трупного материала. Анализ уровней синтеза производных СТГЧ полученными штаммами Е.coli К 802, проведенный иммунологическими методами, дал результаты, представленные в табл.4. При выращивании культур штаммов-продуцентов до более высокой плотности выход производных СТГЧ повышается. Описанный в заявке способ получения плазмидных ДНК позволяет создать целый набор плазмидных ДНК, обеспечивающих в штаммах Е.coli синтез производных СТГЧ. Среди описанных в заявке штаммов, содержащих плазмидные ДНК, есть штаммы - продуценты Мет-СТГЧ, причем в случае штамма ВКМ R15-D уровень синтеза продукта не уступает описанному для штамма Е.coli X 1776, содержащего плазмидную ДНК рНGH 107 (Goeddel D.V. et al. (1979), Nature, 281, 544-548) в случае штамма ВКМ R25-Дон - в три раза выше, чем в штамме аналоге, что обусловлено использованием более сильных промоторов. Как отмечалось, Мет-СТГЧ состоит из 192 аминокислотных остатков, т.е. содержит на одну аминокислоту больше, чем природный СТГЧ. В предлагаемой заявке описаны штаммы-продуценты (дез-Фен¹)-СТГЧ-полипептида, состоящего из 190 аминокислотных остатков, не содержащего дополнительного остатка метионина на N-конце. Предложены также штаммы-продуценты других производных СТГЧ, отличающихся N-концевой областью и представляющих интерес как потенциальные аналоги СТГЧ с несколько измененными свойствами. Использованный для трансформации штамм Е.coli К 802 обладает по сравнению со штаммом Е.coli Х 1776 тем преимуществом, что растет на более простых и дешевых средах, обладает большей скоростью роста, в то же время стабильно поддерживая плазмидные ДНК. Создание штаммов-продуцентов ряда производных СТГЧ - позволяет значительно расширить производство этих гормональных препаратов, что даст возможность использовать их не только для лечения гипофизарного нанизма (фактически единственная сфера применения гормона в медицине в настоящее время), но и для других целей, таких как лечение сложных переломов, ожогов, язв.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 38 + 4/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-Глу-Сер-Ала-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV - 5 - промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 726 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 726 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1072 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1347 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 154 и 4305 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CGT CGT CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC CTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACT CCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область lac UV - 5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез β -лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 2. Рекомбинантная плазмидая ДНК pSTH 33 + 3/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-Гли-Сер-Ала-соматотропина человека, которая состоит из: большого EcoRI - Hind III-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV - 5-промотор размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 723 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 723 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1069 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1344 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 151 и 4302 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами, имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG CAA GAT GGC AGC CCC CGC ACT CGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGG TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b -лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 35 - 0/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV - 5-промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 714 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 714 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1060 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1335 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 142 и 4293 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC TCT TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG CAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGG CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC ACC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGT GACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAA GTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и оперативную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 4. Рекомбинантная плазмидная ДНК psTH 19 - 1/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBP 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV - 5-промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 711 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 711 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1057 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1332 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 139 и 4290 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GTG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TCC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTG CCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную операторную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 5. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 9 - 2/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV - 5-промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 708 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 708 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1054 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1329 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 136 и 4287 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенного между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG GAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGT TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTG ACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCT TGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b -лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 6. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 12 - 4/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - Ecori-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV = 5-промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 702 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 702 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1048 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1323 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 130 и 4281 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CAA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAG AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCT GTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCC ACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 7. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 14 - 10/P - lac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴-Про⁵- Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸- Лей⁹-Фен¹⁰)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - Ecori-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего двойной lac UV = 5-промотор, размером 285 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 684 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 285 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 684 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1030 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1305 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 112 и 4263 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенного между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG GTC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCC TCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTT GCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область lac UV-5. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 100 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 8. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 35 - 0/P - tac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего tac-промотор, размером 275 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 714 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 275 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 714 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1060 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1335 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 142 и 4293 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTT GCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область tac. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 9. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 19 - 1/P - tac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего tac-промотор, размером 275 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 711 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 275 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 711 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1057 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1332 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 139 и 4290 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами, имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATT CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TCC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT CTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAACTTGCCA CTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область tac. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 10. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTH 9 - 2/P - tac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего tac-промотор, размером 275 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 708 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 275 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 708 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1054 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1329 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 136 и 4287 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенного между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCC AGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область tac. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b -лактаматазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 11. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 12-4/P-tac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-соматотропина человека, которая состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего tac-промотор, размером 275 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 702 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 275 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 702 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1048 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1323 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 130 и 4281 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGG CATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTT GCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область tac. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 12. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 14-10/P-tac размером 5,3 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴-Про⁵- Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸- Лей⁹-Фен¹⁰)-соматотропина человека, который состоит из:
большого Hind III - EcoRI-фрагмента векторной плазмиды pBR 322 размером 4331 пар оснований,
EcoRI-фрагмента, содержащего tac-промотор, размером 275 пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 684 пар оснований; содержит:
2 участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 275 пар оснований друг от друга,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 684 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1030 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1305 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 112 и 4263 пар оснований по часовой стрелке от правого EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TGT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCC TGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAA GTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона помещен EcoRI-фрагмент, содержащий промоторную и операторную область tac. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 200 до 1100 пар оснований влево от первого EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 13. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 35-0/P-trp размером 5,8 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-соматотропина человека, которая состоит из:
плазмидной ДНК вектора pBR 322 размером 4,3 тыс. пар оснований,
фрагмента ДНК, содержащего trp-промотор E.coli, размером 0,8 тыс. пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 714 пар оснований; содержит:
1 участок расщепления рестриктазы EcoRI,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 714 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1060 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1335 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 142 и 4305 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTG CCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона слева от EcoRI-сайта располагается промоторная и операторная область trp-оперона E.Coli. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 1000 до 1900 пар оснований влево от EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 14. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 19-1/P-trp размером 5,8 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹)-соматотропина человека, которая состоит из:
плазмидной ДНК вектора PBR 322 размером 4,3 тыс. пар оснований,
фрагмента ДНК, содержащего trp-промотор E.coli, размером 0,8 тыс. пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 711 пар оснований; содержит:
1 участок расщепления рестриктазы EcoRI,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 711 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1057 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1332 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 139 и 4302 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ATC GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCTGTGAC CCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCC ACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона слева от EcoRI-сайта располагается промоторная и операторная область trp-оперона E.coli. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 1000 до 1900 пар оснований влево от EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований вправо от Hind III-сайта. 15. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 9-2/P-trp размером 5,8 тыс. пар оснований, обеспечивающая синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека, которая состоит из:
плазмидной ДНК вектора PBR 322 размером 4,3 тыс. пар оснований,
фрагмента ДНК, содержащего trp-промотор E.coli, размером 0,8 тыс. пар оснований,
EcoRI - Hind III-фрагмента реконструированной кДНК соматотропина человека размером 708 пар оснований; содержит:
1 участок расщепления рестриктазы EcoRI,
1 участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 708 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
1 участок расщепления рестриктазы BamHI, расположенный на расстоянии 1054 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
участок расщепления рестриктазы SalGI, расположенный на расстоянии 1329 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта,
2 участка расщепления рестриктазы Pst I, расположенных на расстоянии 136 и 4299 пар оснований по часовой стрелке от EcoRI-сайта. Фрагмент реконструированной кДНК соматотропного гормона человека, встроенный между EcoRI- и Hind III-сайтами имеет следующую последовательность нуклеотидов:
AATTCT ATG ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG TTC GAC ACA TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC TAG CTGCCCGGGTGGCATCCT GTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTT GTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCA
Перед последовательностью кДНК соматотропного гормона слева от EcoRI-сайта располагается промоторная и операторная область trp-оперона E.coli. В состав плазмиды входят гены:
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы (устойчивость к ампицилину), расположенный в участке от 1000 до 1900 пар оснований влево от EcoRI-сайта,
tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке размером около 1000 пар оснований влево от Hind III-сайта. 16. Способ конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, обеспечивающих синтез производных СТГЧ под контролем бактериальных промоторов, включающий синтез кДНК на матрице поли-А-содержащей РНК, выделенных известными методами из аденомы гипофиза человека, присоединение к синтезированной двухцепочечной кДНК синтетических Hind III-линкеров, введение кДНК в векторную плазмидную ДНК pBR 322 по Hind III-сайту, трансформацию рекомбинантными ДНК клеток E. coli, отбор клона, содержащего плазмидную ДНК с полной копией кДНК СТГЧ, выделение из этого клона плазмидной ДНК и ее реконструирование путем удаления последовательности нуклеотидов, кодирующей сигнальный пептид, и введение сигнала инициации трансляции и бактериального промотора перед последовательностью, кодирующей СТГЧ, отличающийся тем, что двухцепочечную кДНК фракционируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и для встраивания в векторную плазмиду pBR 322 используют фракцию кДНК размером 750 - 850 пар оснований для реконструирования плазмидной ДНК p - pre - STH 18, содержащей полную копию кДНК СТГЧ, эту плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой EcoRV, обрабатывают в стандартных условиях экзонуклеазой III E.coli, затем нуклеазой S I, к полученной смеси присоединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 синтетический олигонуклеотид, содержащий EcoRI-сайт (GAATTC) и инициирующий ATG-кодон, смесь обрабатывают рестриктазами EcoRI и Hind III, фракционируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и выделяют фракцию размером 700 пар оснований, которую далее вводят в векторную плазмидную ДНК pBR 322 по участкам расщепления рестриктаз EcoRI и Hind III, гибридными плазмидными ДНК трансформируют клетки E.coli, выделяют из трансформатором плазмидные ДНК и отбирают из них путем рестрикционного анализа и определения нуклеотидной последовательности плазмидные ДНК pSTH, содержащие встроенный инициирующий ATG-кодон в рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей СТГЧ, в которые вводят бактериальный промотор перед последовательностью, кодирующей синтез одного из производных СТГЧ. 17. Способ конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P - lac, обеспечивающих синтез производных СТГЧ под контролем бактериального промотора по п. 16, отличающийся тем, что, с целью введения бактериального двойного lac UV - 5-промотора, перед последовательностью, кодирующей одно из производных СТГЧ, рекомбинантную плазмидную ДНК серии pSTH гидролизуют рестриктазой EcoRI, обрабатывают щелочной фосфатазой, смешивают с выделенным из плазмидной ДНК pLJ 3 EcoRI-фрагментом, содержащим 2 тандемно расположенных промотора, обрабатывают смесь ДНК-лигазой фага Т4, трансформируют клетки E. coli, выделяют из трансформантов плазмидные ДНК и с помощью рестрикционного анализа отбирают плазмидные ДНК, содержащие промотор в нужной ориентации. 18. Способ конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P - tac, обеспечивающих синтез производных СТГЧ под контролем бактериального промотора по п. 16, отличающийся тем, что, с целью введения бактериального гибридного tac-промотора, перед последовательностью, кодирующей одно из производных СТГЧ, рекомбинантные плазмидные ДНК серии pSTH гидролизуют рестриктазой EcoRI, обрабатывают щелочной фосфатазой, смешивают с выделенным из плазмиды pBR - tac - EcoRI-фрагментом, содержащим гибридный tac-промотор, обрабатывают смесь ДНК лигазой фага Т4, трансформируют клетки E.coli, выделяют из трансформантов плазмидные ДНК и с помощью рестрикционного анализа отбирают плазмидные ДНК, содержащие промотор в нужной ориентации. 19. Способ конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P - trp, обеспечивающих синтез производных СТГЧ под контролем бактериального промотора по п. 16, отличающийся тем, что, с целью введения бактериального trp-промотора, перед последовательностью, кодирующей одно из производных СТГЧ, рекомбинантные плазмидные ДНК серии pSTH гидролизуют рестриктазами BamHI и EcoRI, выделяют фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую одно из производных СТГЧ, смешивают его с плазмидной ДНК pBR - trp, обработанной рестриктазами BamHI и EcoRI и бактериальной щелочной фосфатазой, обрабатывают смесь ДНК-лигазой фага Т4, трансформируют клетки E. coli, выделяют из трансформантов плазмидные ДНК и с помощью рестрикционного анализа отбирают плазмидные ДНК со встроенным фрагментом. 20. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 38 + 4/P - lac, ВКМ R13 - D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-соматотропина человека. 21. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 33 + 3/P - lac, ВКМ R14-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-Гли-Сер-Ала-соматотропина человека. 22. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 35 - 0/P - lac, ВКМ R15-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-соматотропина человека. 23. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 19 - 1/P - lac, ВКМ R16-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент (дез-Фен¹)-соматотропина человека. 24. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 9 - 2/P - lac, ВКМ R17-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека. 25. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 12 - 4/P - lac, ВКМ R18-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴)-соматотропина человека. 26. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 14 - 10/P - lac, ВКМ R19-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷- Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-соматотропина человека. 27. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 35 - 0/P - tac, ВКМ R20-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-соматотропина человека. 28. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 19 - 1/P - tac, ВКМ R21-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент (дез-Фен¹)-соматотропина человека. 29. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 9 - 2/P - tac, ВКМ R22-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека. 30. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 12 - 4/P - tac, ВКМ R23-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴)-соматотропина человека. 31. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 14 - 10/P - tac, ВКМ R24-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²- Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷- Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-соматотропина человека. 32. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 35 - 0/P - trp, ВКМ R25-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-соматотропина человека. 33. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 19 - 1/P - trp, ВКМ R26-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент (дез-Фен¹)-соматотропина человека. 34. Штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 9 - 2/P - trp, ВКМ R27-D (Коллекция ИБФМ АН СССР) - продуцент Мет-(дез-Фен¹-Про²)-соматотропина человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 35-2000

(73) Патентообладатель:
ООО "С.К. И Ф.Ф." (RU)

Договор № 11288 зарегистрирован 29.09.2000

Извещение опубликовано: 20.12.2000        

---