Способ получения ростового протеина

 

СОЮЗ СООЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3781640/28-14 (22) 17,08. 84 (46) 15.08. 86. Бюл. И- 30 (71) Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI.À.Òàðàñåâè÷à (72) С.Г. Дзагуров, Л.И.Игудин и Г.А.Маркиан (53) 578.085.23(088.8) (56) Tytell et al. Replacement of

Animal Serum Proteins by Human albumin for growth and Interfегоn

Production by Namalva Cells °

United States Patent, Apr. 15, 1980, 4, 198, р. 479.

Michl I. Rezacova D. Cultivation

of Mammalian Cells in à Medium with

growth-promoting protein from calf

serum. — Acta virology, 1966, В 10, р. 254-259, (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОСТОВОГО

ПРОТЕИНА. путем многократной обработки сыворотки крови животных осае„„SU„„1250573 А 1 (504 С 12 И 5/00/А 6ГК 35/Я дающим реагентом, экспозиции смеси и ее центрифугировання после каздой обработки с паследуюг им отделением осадка, очисткой и стерилизацией целевого продукта, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повьппения чистоты целевого продукта, обработке подвергают сыворотку крови крупного рогатого скота, в качестве осалщающего агента используют 30-407-ный водный раствор полиэтиленгликоля с мол.м.

3000 — 6000 дальтон, обработку осуществляют двукратно, при этом при первой обработке раствор полиэтиленгликоля добавляют к сыворотке до конечной концентрации 8-107, а при второй — до 14-16Х экспозицию смеси проводят в течение 10-20 мин, при этом после первой обработки и центрифугирования рН супернатанта доводят до 5,3-5,6 уксусной кислотой,.а перед очисткой осадок растворяют в забуференном растворе хлористого натрия с рН 8,0-9,0.

1250573

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при работе с клеточными культурами и в вирусологии.

Целью изобретения является упрощение способа и плвьппение чистоты целевого продукта за счет улучшения осаждения целевого продукта.

Пример 1. К 80 мл сыворотки крупного рогатого скота добавляют

20 мл 40Х-ного водного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000-4000 дальтон. Смесь интен" сивно встряхивают. Полученную суспенэию после экспозиции в течение

10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при 2000-3000 об/мин

10 мин.Надосадок сливают в 100-граммовый флакон, добавляют при встряхивании 15Х-ный водный раствор уксус, ной кислоты из расчета 1,0-1,2 мл кислоты на 80 мл надосадка с последующим добавлением 20 мл 40Х-ного раствора полиэтиленгликоля. Полученную взвесь тщательно встряхивают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют 10 мин при 2000-30000 об/мин, Надосадок удаляют, осадок однократно промывают заранее приготовленным забуференным физиологическим раствором рН 8,0-9,0 и растворяют в 100 мл этого же растворителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны типа ИМ-2 фирмы Амикон до концентрации общего белка в препарате

4-6Х. Затем препарат стерилизуют путемфильтрации и используют в работе.

Пример 2. К 80 мл сыворотки крупного рогатого скота добавляют

20 мл 35Х-ного водного раствора полиэтиленгликоля с MM 3000-6000 дальтон. Смесь интенсивно встряхивают, Полученную суспензию после экспозиции в течение 10-20 мин при комнатной температуре центрифугируют при

2000-3000 об/мин в течение 10 мин.

Надосй 1ок сливают в 100-граммовый флакон, добавляют при встряхивании

15Х-ный водный раствор уксусной кислоты иэ расчета 1,0-1,2 мл кислоты на ЯО мл надосадка с последующим добавлением 35Х-ного раствора полиэтиленгликоля с ММ 5000-6000 дальтон до конечной концентрации 1416Х. Полученную взвесь тщательно

ВНИИПИ Заказ 4376/20

Произв.-полигр. пр-тие, встряхивают и выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при 20003000 об/мин. Надосадок удаляют, оса док однократно промывают забуференным физиологическим раствором рН

8,0-9,0 и растворяют в 100 мл этого же растворителя. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны типа ИМ-2 до концентрации общего белка в препарате 4-6Х.Затем препарат стерилиэуют путем фильтрации

1О

Споооб осуществляют в течение

1 сут. тогда как известный .способ занимает около 7 сут, позволяет получить более чистый препарат (содержание 7 -глобулиновой фракции менее 0,5Х, в прототипе — 5-8X).

Ростовой протеин используют следующим образом.

Культивирование линии клеток

Л „„с применением ростового протеина.

Проведено 5 пассажей с посевной дозой 100000 кл/мл и 2 пассажа с посевной дозой 40000 кл/мл. При посевной дозе 100000 кл/мл в каждом пассаже клетки формируют монослой на 3-4 сут. Индекс пролиферации (ИП) после 5-го пассажа составляет 8,7.

При посевной дозе 40000 клеток в мл монослой формируется на 5-6 сут

ИП-7,2. При обеих использованных посевных дозах клетки в пассаже сохраняют типичную морфологию без признаков дегенерации. Культивирование линии диплондных клеток М-19, с применением ростового протеина.

Проведено 4 пассажа с посевной дозой 200000 кл/мп. В каждом пас30

40 саже клетки формируют монослой на

3-4 сут с характерной морфологией без признаков дегенерации. ИП после 4 пассажа - 2,05.

На первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов в возрасте 9-10 дней испытания ростового протеина на ростстимулирующую активность проводились с концентрациями препарата, Х: 10, 1, 0,5, 0,25, 0,12 при посевной дозе

300000 кл/мл. Монослой формируется на 2-3 сут. Препарат обладает рост50 стимулирующей активностью в концент55 рациях О, 25 — 1 .

Тираж 490 Подписное

Ужгород, ул. Проектная 4.и используют при культивировании клеток человека и животных.