Штамм @ @ ат-490 - продуцент целлюлаз

 

Штамм Aspergillus terreusAT- 490 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИ- генетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232) - продуцент целлюпаэ. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ае (и) (5И 4 С 12 И 9/42, 1/14 (С 12 N 9/42, С 12 R 1:645) В«. " «;» . c л

11

k9...

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3755497/28-13 (22) 27 ° 06.84 (46) ?3.08.86. Бюл.И» 31 (71) Институт микробиологии АН СССР и Институт биохимии растений АН ГССР (72) Г.И.Квеситадзе, Л.Л.Квачадзе, Т.И.Алексидзе, Л.Г.Логинова, И.И.Иванова и Э.П.Гужова (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

11 994555, кл. С 12 N 9/42, 1981.

Авторское свидетельство СССР

Ф 1125247, кл, С 12 N 9/42, 1983.

Логинова Л.Г., Гужова Э.П., Бурденко Л.Г. Прикладная биохимия и микробиология. 1978, т.14, вып,4, с.485, (54) ШТАММ ASPERGILLUS TERREUS AT490 — ПРОДУЦЕНТ ЦВЛЛИЛАЗ (57) Штамм Aspergillus terreusAT490 (коллекция Центрального музея промьпппенных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ

F-232) — продуцент целлюлаз.

1 12

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению целлюлолитических ферментов микробного происхождения, используемых в процессе осахаривания целлюлозы.

Цель изобретения — штамм микроскопического гриба †. продуцент термостабильных высокоактивных целлюлаэ, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу.

Предлагаемый штамм Aspergillus

terreus AT-490 получен в результате ультрафиолетового облучения исходного штамма Aspergillus terreus 17Р дозой 6400 Дж/м .

111тамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов

Института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232.

Предлагаемый штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Культура хорошо развивается на среде Чапека-Докса, модифицированной среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта и полоски фильтровальной бумаги на поверхности агара, сусло-arape, а также на природных питательных субстратах.

Среда Чапека-Докса, На 5-е сутки колонии желтоватые, постепенно переходящие в бежевый цвет, бархатистые, плоские. Обратная сторона бес1 цветная. Мицелий гриба имеет тонкие гифы, слабо септированные или совсем не септированные. Средняя толщина гиф 3 — 4 мк. Конидиеносцы гладкие, бесцветные, до 100 мк в длину и 68 мк в ширину. Пузыри полусферические 15-18 мк в диаметре. Их верхняя часть покрыта стеригмами. Стеригмы двухъярусные, обычно тесно прилегающие, стеригмы первого яруса (3-4)

«2 мк, второго яруса (5-6) 2 мк.

Конидиии эллиптические, гладкие, встречаются по отдельности или соединены в цепочки. Диаметр конидии 23 мк.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо усваивает лактозу, глюкозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу и целлюлозу. Слабее усваивает арабинозу, галактозу, крахмал и маннит.

Не усваивает рамнозу, рафинозу, маннозу и сорбит. Иэ источников азота хорошо усваивает органические и не52336 2

55 органические соединения азота. Наиболее интенсивный рост наблюдается на нитратах. Усваивает разнообразные фосфорные соединения, однако более интенсивно одно- и двуэамещенный фос форнокислый калий. Штамм высокую эндоглюканазную (p-1,4-V-глюкан-4-глюканогидролаэы) и целлобиаэную активности выявляет в пределах рН

4,5 — 4,6. Оптимальная температура для роста и биосинтеза 40 С. Штамм гидролизует целлюлозу (разные целлюлозные субстраты). Наблюдается высокая эндоглюканазная и целлобиаэная активности на среде, содержащей сено в качестве единственного источника углерода.

Целлюлаза предлагаемого штамма термостабильна — после ведения ферментативной реакции при 70 С в течение часа активность почти полностью сохраняется.

Для размножения штамма применяют модифицированную агариэованную среду

Чапека-Докса состава, : NANO> 0,3;

КН Р040,2; MgSO„ 7H Î 0,05; кукурузный экстракт 1,5; агар-агар 2,0, полоска фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3.

Посевным материалом служит суспензия 20- суточной культуры штамма, выращенной на модифицированной среде

Чапека-Докса. Для получения целлюлаз используют жидкую питательную среду состава, : 11аЬО 0,30; КН,РО< 0,2;

М8804 7Н20 0,05 -ено 2 кукурузный экстракт 1,5, рН среды 4,5.

150 мл питательной среды в конических колбах емкостью 250 мп стерилизуют 40 мин при 0,7 атм. Максимальная активность целлюлаз отмечается при выращивании штамма на термостатирован. ной качалке, делающей 270 об/мин при 40 С в течение 96 ч и равна: активность эндоглюканазы по КМЦ

20 ед/мл, активность по фильтровальной бумаге 0,5 ед/мп, по целлобиазе 0,5 ед/мл.

Эндоглюканазную активностьопределяют по действию фермента íà Na

KMU следующим образом. I мл 1,5 ного раствора субстрата в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в

0 течение 30 мин при 60 С. За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих сахаров при 1 -ной конl С, Са Эидоглюкаиаза, Йеллобиаза, мг глюкозы/ил/г иг глюкозы!ил/г икиольlилlиин икиоль/ил/мин

Штамм

Авр. Сеттеров ВКМ

F 2220D

3,5

4,0

О,!

Лвр.terreus AT-490 4,9-5,0!

30,0-138,0 6,0-7,0 0,7

ВНИИПИ Заказ 4588/27 Тираж 490

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 12523 центрации субстрата в минуту. Количество восстанавливающих сахаров определяют по методу Сомоджи-Нельсона.

Активность по фильтровальной 5 бумаге определяют следующим образом. 50 мг фильтровальной бумаги

"Ватман 1! 1" (! 6 см) в 1 мл 0,05М ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в to о течение часа при 55 С. За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1 мкмоль восстанавливающих сахаров в минуту. Количество восстанавливающих сахаров 15 определяют по методу Сомоджи-Нельсона.

Целлобиазную активность определя ют следующим образом. 0,2 мл

2 10 моль целлобиазы, !,6 мл

0,05М ацетатного буфера (pH 4,7) и 0,2 мл раствора культуральной жидкости инкубируют в течение

10 мин при 55 С. За единицу активноо сти принимают количество фермента, 25 образующее 2 мкмоль глюкозы за 1 мин при концентрации целлобиазы 2 10

«1О моль. Определение глюкозы проводят глюкозооксидазным методом.

Кроме высокоактивных целлюлаз

30 предлагаемый продуцент образует богатую белком (35-40X) биомассу.

Пример 1. Штамм Aspergillus

„terreus AT-490 выращивают на агаризованной среде, "îäåðæàùåé, 7.:

35 кукурузный экстракт 1,5; NANO> 0,3;

КН Р04 0,2; MgSO< 7HzO 0,05, рН и полоску фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3.

Культивирование проводят в течение о 40

72 ч при 40 С. Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 250 мл, содержащие 150 мл среды состава, 7.: сено 2,0, кукурузный экстракт 1,5;

NaNO 0,3; КН РО 0,2; MgS04 7Н О

0,05, рН среды 4,5. Выращивание культуры проводят на круговой качалке (270 об/мин) в течение 72 ч при

36 4

40 С. Мицелий с остатками сена отделяют, и в культуральной жидкости определяют активности целлюлаз по укаэанным методам. Активность эндоглюканазы по Na КМЦ 14,5 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге

0,32 ед/мл; по целлобиозе 0,35 ед/мл.

Пример 2. Штамм Aspergillus

terreus AT-490 выращивают согласно примеру 1 в течение 96 ч. Активность целлюлаз определяют аналогично примеру 1.

Активности ферментов в культуральной жидкости составляют, ед/мп: эндоглюконаэа по Иа КМЦ 20; активность по фильтровальной бумаге 0,5; по хлопку 0,9-1,0; целлобиаза

0,5 ед/мл, ксиланаза 7-8.

При выдерживании препарата при о

70 С в течение часа активности почти полностью сохраняются.

Мутант Asp. terreus AT-490 обладает не только набором всех ферментов целлюлазного комплекса, но также и высокой ксиланаэной активностью.

В препаратах целлюлаз ксиланаза обеспечивает более полное расщепление сельскохозяйственных отходов до глюкозы. Ксиланазы гидролиэуют гемицеллюлоэу, которая содержится в растительных и природных субстратах, таких как солома, древесина и т.д.

Пример 3. Штамм Asp. terreus

AT-490 выращивают в колбах Эрленмейера 250 мл, содержащей

100 мл среды состава, г/л водопроводной воды: древесные опилки, измельченные на шаровой мельнице до размеров 0,2-1,0 мм 20,0; NANO> 3,0;

РО4 2 0 MgSOq ° 7Н 0 0,5,pH„4

4,6, в течение 96 ч, на круговой качалке (230 об/мин)при 40 С, Культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугиронанием и опре деляют активность по укаэанным методам.

Активность ферментов представлена в таблице.