Способ получения оксикислот или их лактонов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РНИЪЬЛИК

89 (и) СЮ 4, С 12 P 1/02//A 61 К 35/70 (С12Р102 C12R166

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Иьмь (72) Ричард Л. Монагэн, Альфред

В. Альберте (US), Джордж АльберсСконберг (СН), Генри Йошуа, Мария Б. Лопез и Карл Х:Хоффман (US)t (53) 615 ° 779.932 (088,8) (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИКИСЛОТ

ИЛИ ИХ ЛАКТОНОВ общих формул

СООН

0Н занных соединений из ферментационной смеси экстрагированием растворителем и последовательной хроматографией.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2935800/30-15, (22) 13.06.80 (31} 77807 (32) 21 ° 09.79 (33) US (46) 23.08.86. Бюл. Ф 31 (71) Иерк энд Ко., Инк. (QS) путем ферментации питательной среды штаммом Aspergillus terreus АТСС

У 20542 с последующим выделением укаNCPC053P, 1

l3 .," ц

1253432 2 ществ, обладающих гипохолестеремической активностью, общих формул

О 3

С00Н

ОН

Эти соединения подавляют биосинтез холестерина и могут быть использованы для лечения атеросклероза, гиперлипемии и других подобных заболеваний, а также в качестве противоплесневых агентов.

Оксикислоты или их лактоны получают путем ферментации питательной среды штаммом Aspergillus terreus

АТСС У 20542 с последующим выделением соединений из ферментационной . смеси экстрагированием растворителем и последовательной хроматографией.

Штамм Aspergillus terreus (обоз* наченный NF-4845} в собрании культур (фирма Мерк энд Ко., Инк,, Ревей, Нью-Йорк) помещен на постоянное хранение в коллекцию Американского

Собрания Видов Культур, 12301, Паркалун Драйв, Роквилл, Мэриленд 20852 и получил номер по каталогу АТСС

У 20542.

Морфологическая характеристика микроорганизмов АТСС Р 20542 аналогична морфологическим характеристикам рода Aspergillus. В результате сравнения с известными видами установлено, что штамм принадлежит виду

Aspergillus terreus.

Выращивание этого штамма с целью получения новых соединений осуществляется в водной среде, обычной для получения других продуктов ферментации. Такая среда содержит источники углерода, азота и неорганичесИзобретение относится к способу получения новых лекарственных векие соли, которые устаиваются микро-.,25 организмами.

Углеводы, такие как сахара, например глюкоза, фруктоза, мальтоэа, сахароза, ксилоза, манитол и т.п., крахмалы, такие как крахмал зерна, например овса, риса, кукурузный крахмал, кукурузная мука крупного помола и т.п., можно использовать, как по отдельности, так и в комбинации, в качестве источников усваиваемого

35 углерода в питательной среде, Точное количество источника или источников углеводов, которое используется в среде, зависит частично от других ингредиентов, содержащихся в среде, 40 но в общем случае количество углеводов обычно варьируется в пределах от 1 до 6 вес.7 среды. Источники углерода можно использовать по отдельности или несколько таких источ Я ников углерода используется в комбинации. В качестве источников азота в процессе ферментации можно использовать протеиновые материалы. K соответствующим источникам азота относятся, например, гидролизаты дрожжей, первичные дрожжи, мука крупного помола соевых бобов, мука семян хлопка, гидролиэаты казеина, насыщенный ликер кукурузы, растворимые вещества из дистиллятора или томатная паста и т;и. Источники азота используются либо по отдельности, либо в комбинации в количествах от 0,2 до 6 вес.Х от веса водной среды.

3 12534

К питательным неорганическим солям, которые можно использовать в среде для выращивания культуры, относятся обычные соли, содержащие натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, 5 сульфат, хлорид, карбонат и другие подобные ионы. Они также могут содержать следы металлов, таких как кобальт, марганец, железо и магний.

Ферментация осуществляется при 10

20-37 С. Однако с целью получения оптимальных результатов ферментация осуществляется при 22-30 С. рН питательной среды, предназначенной для культивирования Aspergillus и получения новых соединений, может варьироваться от б,0 до 8,0.

Хотя новые соединения выра. батываются культурой как на поверхности, так и в погруженном состоянии, процесс ферментации осуществляется в погруженном состоянии. В небольших масштабах ферментация в общем случае осуществляется при помощи внесения на соответствующую питательную сре- 25 ду культуры Aspergillus и затем, после переноса питательной среды с привитой культурой в среду для продуцирования, ферментация осуществляется при постоянной температуре около 28 С в течение нескольких дней при периодическом встряхивании.

Соединения III u IV (особенно

III) можно выделить известным способом без использования хроматографии в форме солей аммония, Такой способ выделения является более удобньм и гораздо больше приспособлен для промьппленного использования, чем хроматография. Кроме того, соли соединения III u IV являются гораздо более активными, чем соединения I u II в реальных условиях с целью ингибирования процесса биосинтеза холестерина и в качестве протиФерментация инициируется в стерилизованной колбе со средой при помощи одной или нескольких стадий 35 развития семян. Питательной средой для стадии семени может быть любая подходящая комбинация источников

% углерода и азота. Колба с семенами выдерживается в камере при постоян- 40 ной температуре около 28 С в течение двух дней при периодическом встряхивании или до тех пор, пока рост не достигнет удовлетворительного уровня и часть полученной в ре- 45 зультате для прививки потомства второй стадии или среды для продуцирования. Колбы с потомством промежуточных стадий, если таковые используются, культивируются по существу 50 тем же способом, т.е. часть содержимого колбы со стадии последнего потомства используется для прививки среды для продуцирования. Колбы с привитой культурой встряхиваются 55 при постоянной температуре в течение нескольких дней, а в конце периода инкубирования содержимое колб

32 4 подвергается центрифугированию или фильтруется.

Для реализации в более значительных масштабах ферментация осуществляется в подходящем резервуаре,снабженном мешалкой и средствами для аэрации средь1 Ьерментации. В соответствии с предлагаемым способом питательная среда загружается в резервуар и стерилизуется при помощи нагревания примерно до i20 Ñ. После охлаждения стерилизованная среда прививается предварительно выращен- ными семенами (потомством) продуцирующей культуры и процесс ферментации продолжается в течение, например, 3-5 дней. Одновременно осуществляется перемешивание и/или аэрация питательной среды и поддерживается температура примерно 28 С. Этот способ биосинтеза новых соединений предназначен, в частности, для получения больших количеств.

Соединения известным способом выделяются иэ бульона для ферментации.

Соединения I u II можно подвергнуть гидролизу с основаниями, такими как NaOH чтобы получить соли, такие как соли натрия соединений III u IV. Используя основания с другими приемлемыми с фармацевтической точки зрения катионами, можно получить соли этих катионов. Аккуратное подкисление солей дает оксикислоты III и IV, которые можно превратить в соединения I u II npu кислотных значений рН. Обрабатывая соединения I u II при помощи кислотного или щелочного катализа с металлометанолом, этанолом, пропанолом или бутанолом, или с фенил, диметиламино или ацетиламино алканолами, получают соответствующие сложные эфиры соединений III u IU.

1253432

5 воплесневых агентов. В действительности, оксикислоты (и их соли) являются активными формами. Следовательно, такие соли являются более предпочтительными, в частности, при использовании в форме доз. Кроме солей аммония; являются и соли тетраметил" аммония и соли этилендиамина, натрия, калия, кальция, И-метилглюкамина, лйзина, аргинина и орнитина.

Указанные соединения являются фармакологически активными соединениями и могут применяться как лекарственные препараты стоматическим или парентеральным способом в форме капсул, таблеток, инъекций и т.п.

Б общем случае используется стоматический способ применения. Дозы можно варьировать я зависимости от возраста, степени заболевания, веса тела и других факторов человека, но ежедневная доза для возрослого паР циента содержится в области пример" но от 2 до 2000 мг(в прецпочтитель,ном варианте 2-100 i«r), которая может быть разделена »а две — четыре отдельные дозы. При »еобходнмости можно использовать и более высокие дозы.

СОединения можнО также испОль зовать в качестве противоплесневых агентов.

Пример 1. Ферментация.1Ionбирка с лиофилизованной культурой

As1IегЯi11пз terгепз ATCC У 20542 открывается в стерильных условиях и содержимое суспендируется в 250 мл колбу Зрленмайера без перегородки (семен»ая колба l1)р содержащую

40 мл среды С, которая имеет следую« щий состав, г:

Насыщенный кукурузный ликер 5

Томатная паста 40

Овсяная мука крупного помола 10

Глюкоза 10

Среды элементов смеси Р 2 10

Дистиллированная вода 1000 мл рН 6,8 нри помощи ИаОН. Колба с привитой культ>рой инкубируется в течение 24-48 ч при 28 С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах или амплитуда 5,08 см). Часть

{примерно 0,5 мл) содержимого этой колбы затем используется для прививки культуры и наклонной пробирке, содержащей среду Е. Среда К имеет следующий состав, г;

Зкстракт дрожжей 4

Солодовый экстракт 10

Декстроза 4

Агар 20

Дистиллированная вода 1000 мл рН 7,0 при помощи NaOH.

Наклонная пробирка с привитой культурой инкубируется в течение

1i дней при комнатной температуре.

Затем она хранится при -60 С в тече". ние 3-4 мес. Часть содержимого этой

10 пробирки затем суспендируется в

250-миллилитровую колбу Зрленмайера без перегородки {семенная колба 2), содер:кащую 40 мл среды С. Колба с привитой культурой инкубируется в течение 24 ч при 28 С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах, 5.08 см), Приготавливаются шесть колб Эрлекмайера емкостью 250 мл без перегородки, содержащих 40 мл

2О среды С ° Затем в каждую КОлбу прививается культура при помощи 2 мл на каждую колбу содержимого семенной колбы 2. Зти шесть колб инкубируются в течение 48 ч при 28 С на вибрато25 ре, совершающем 220 кол./мин (размах 5,08 см). Затем берут шесть двухлитровых колб Зрленмайера, содержащих среду F в объеме 500 мл, и в каждую колбу прививается культура при помощи содержимого семенной колбы 3. Среда Г имеет следующий состав, г:

Насыщенный кукурузный 15

Крахмал СРС 20

Кукурузная мука грубого помола 1

1змельченные соевые бобы 4

Глюкоза 5

Соевое масло 2,5 (ИН,,),SO, 4

40 Кн,ро, 0,3

СаСО, б

Дистиллированная вода 1000 мл

Н при помощи N OH

Колбы с привитой культурой инку45 бируются в течение 11 дн. без перемешнвания при 28 С. После инкубирования в течение 11 дн. бульон подвергается зкстрагированию.

Экстрагирова»ие .

Весь бульон рн 6,0 смешивается в смесителе Баринга с тем, чтобы разбить тяжелый слой мицелия, центрифугируется и прозрачный верхний слой декантируется. После фильтра55 ции 10 л фильтрата экстрагируется при помощи 3 л этилацетата, в результате чего получается 1820 мл прозрачного экстракта. Второе экстраги

1253432

Общая активность, ед.

Объем, мл Общее содержание твердых частиц, мг

1144067

1 820

2i 00

1133

787

13 16

Гель-фильтрация.

Весь твердый материал, полученный из первых двух экстрактов, соединяется вместе, растворяется в метаноле и фильтруется с целью удаления нерастворимых твердых частиц, I

30 мл фильтрата загружается в колонку для гелевой фильтрации (2,5 200 см, 980 мл), заполненную материалом Сефадекс LH-20, и проба фракционируется в соответствии с размером молекул при помощи метанола, который используется в качестве растворителя. Используя индекс преломляемости и данные УФ-анализа, наилучшие фракции определяются при помощи биоаналнза (см.табл.2).

Таблица 2 е содер- Общая активность, ед. е тверчастиц.

2

89

278

779

106271

2103 7 рование при помощи 3 л этилацетата дает 3350 мн прозрачного экстракта..

Твердое вещество бульона экстрагируется при помощи перемешивания в течение 1 ч с использованием 2 л метанола и после фильтрации получается 2100 мл фильтрата.

Порции этих экстрактов сушатся и направляются для анализа. Фильтраты испытываются как ингибиторы фермента редуктазы НМС-СоА методом, описанным Бегом, Стоником и Бревером.

При этом используются ферменты, полученные в соответствии с описанием, приведенным Клейнзеком, Рангатамом и Портером. Положительный тест — ингибирование составляет более 907 при 20 мкг/мл IC составляет

2,3 мкг/мл, что указывает на присутствие очень сильного ингибитора синтеза холестерина, действующего на содержание редуктазы НМС-СоА.

Результаты анализа экстракта приведены в табл.1.

Т а блица

55

1О

Выделение и очистка, Проба из фракции 2 предварительно фильтруется через слой в 1 r материала Уотерс Бондапак С18 /Поразил В и элюируется пятью объемами метанола. Метаноловый элюат концентрируе-ся до съема 0,5 мл. эта проба подвергается хроматографии несколько раз на материале Уотерс С 18, . из которого изготовлена колонна (3,9 мм 20 см), причем в качестве проявляющего растворителя используется смесь метанол: 0,05 М раствор фосфата аммония, рН 2,9, (75:25).

Фракции исследуются на спектрофотометре Бекмана и те фракции, для которых максимум поглощения соответствует 236 нм с изгибами в 229 и

245 нм, соединяются и концентрируются при пониженном давлении до водного раствора. рН концентрата довогчтся до 6,5 при помощи 2 N раствора гидрата окиси калия и активные компоненты экстрагируются этилацетатом.

Органический слой сушится, концентрируется до сухости и остаток раст- . воряется в 0,3 мл метанола. Метаноловый раствор подвергается хроматографии и рециркулируется. Фракции, содержащие ранее элюированную компоненту, соединяются, концентрируются до водного раствора и зкстрагируются хлороформом. Остаток из хлороформа помещается в метанол и растворитель выпаривается в атмосфере азота, 3,5 мг высушенного продукта, полученного таким образом, идентифицируется как оксикислота (соединение III).ôðàêöèè,содержащие вторую компоненту, соединяются и экстрагируются хлороформом. Получено 0,87 мг высушенного продукта, который идентифицирован как лактон (соединение I).

Физико-химические свойства соединения Х (И$Э-803) приведены ниже: т.пл. 170-171 С, молекулярный вес (масс-спектроскопия) 404, формула—

С Н2605 (найденО IlpH помощи масс спектроскопии 402,555, рассчитано

404, 2563), УФ-спектр (в ацетонитриле), нм: 230,5 с Е% 505,7, 237,5 с Е7. 576,6; 246 с EX 395,2.

С. ЯМР химические сдвиги. Спектр получен в растворе CDC1 (20,1 мг в 0,35 мл). Химические сдвиги приведены относительно внутреннего тетраметилсилана при нуле ррм, при

1253432

9 экспериментальных условиях импульс ,растворителя (CDC1 ) имеет место в области 70, 0 ррм (долей на миллион).

Обнаружено 24 атома углерода, что согласуется с данными масс-спектроскопии, они имеют следующие химические сдвиги, ррм: 11,5, 13,6; 16,0;

22т6 24 1; 2616 27в2; 30ю5; 32э5;

131,7; 133,2; 170,8 и 177,2.

Оптическое вращение.

Характерное оптическое вращение

l+3> = 320,7 определяют на растворе 5,30 мг/мл СН,CN. Это значение получено при помощи измерения длины волны линии натрий-D.

На основе этих и других данных можно предположить, что продукт имеет следующую химическую стереоструктуру

Соответствующая оксикислота (соединение III) имеет структуру

Пример 2. Пробирка с лиофилизованной культурой Aspergi.11ès

terreus АТСС Р 20542 .открывается в стерильных условиях и содержимое суспендируется в 250-миллилитровую колбу Эрленмайера без перегородок (семенная колба), содержащую 40 мл среды С.. Колба с привитой культурой инкубируется в течение 30 ч при

28 С на вибраторе, совершающем

220 кол./мин (размах 4,08 см). В

250-миллилитровую колбу Эрленмайера

I без перегородки, содержащую 40 мл среды G, прививается культура при помощи 2 мл на колбу содержимого семенной колбы. Среда G имеет следующий состав.

Декстроза 45

Петонизированное молоко 24

Аутолизированные дрожжи 2,5

Полиголиколь Р2000 2,5 мл

Дистиллированная вода 1000 мл рН 7,0 при помощи NaOH

Колба с привитой культурой инкубируется в течение 120 ч при 28 С на вибраторе,совершающем 220 кол./мин

1О (размах 5,08 см). После 120 ч инкубирования содержимое колбы подвергается экстрагированию в соответствии с процедурой из примера 1. Общая производительность составляет 21

500 ед./мл.

Пример 3. Ферментация. Пробирка с лиофилнзованной культурой

ЛТСС Ф 20542 открывается в стерильных условия и содержимое суспендируется в 250 мл колбу Эрленмайера без перегородки (семенная колба), содержащую приблизительно 10 мл среды, которая имеет следующий состав,г

Насыщенный кукурузный ликер 5

25 Томатная паста 40

Овсяная мука грубого помола 10

Глюкоза 10

Раствор следов элементов 10

Дистиллированная вода 1000 мл рН 6,8 обеспечивается при помощи

Na0H.

Раствор следов элементов, мг:

Ге804 . 7Н,О 1000

ИпБО 4Н О 1000

СпС1 2Н О 25

СаС1, 2Н, О 100

HÇ Во3 56 (NH4 ) 6 No 0>< 4Н О: 19

ЕПЯОл 7Н2 О 200

Дистиллированная вода (деионизированная) 1000 м

Колба с привитой культурой инкубируется в течение 24 ч при 28 С на

4> вибраторе,совершающем 220 кол./мин (размах 5,08 см). Затем в двухлитровую колбу Эрленмайера без перегородки, содержащую 500 мл среды,прививается культура при помощи 10 мл содержимого первой стадии ферментации из семенной смеси. Эта колба также находится на вибраторе в течение 24 ч при 28 С.

В бак для ферментации из нержа55 веющей стали емкостью 200 гал (757 л) загружается 485 л среды, содержащей целлюлозы 4,5 вес/об., пептонизированного молока 2,5Х вес/об., ауто11 1 лизованных дрожжей 0,25 вес/об., полигликоля — P2000 0,25 . об/об. рН среды доводится до 7,0. Содержимое стерилизуется в течение 15 мин при

121 С. Затем в бак заливается один литр содержимого со второй стадии и смесь инкубируется на вибраторе, совершающем 85 кол./мин, в течение

12 ч, затем на вибраторе, совершающем 130 кол./мин в течение 84 ч при

28 С при подаче воздуха со скоростью

5 0 142 м /мин в течение 12 ч, а затем со скоростью 10 0,34 м /мии в течение 84 ч, Экстрагирование.

Соединяются две одновременно загружаемые порции в сто гал (378 л) бульона, подкисляются при перемешивании до рН 4, 1 при помощи аккуратного добавления 800 мл концентрированной соляной кислоты и экстрагируются добавлением 75 гал (284 л) этилацетата, затем перемешивание продолжается в течение 2 ч.

Затем добавляется примерно 25 футов (11,34 м кг) кремнистого вспомогательного фильтрующего материала и весь полученный шламм пропускается через 61 см фильтр-пресс. Дополнительно 75 гал (284 л) этилацетата используется для промывки спрессованной лепешки и продолжения экстрагирования при помощи обращения направления подачи этилацетата через пресс. Эта процедура осуществляется четыре раза. Затем весь промывочньп1 растворитель сливается из пресса и соединяется с первым фильтратом.

Двухфазной смеси (фильтрату) дают возможность отстояться и водный слой удаляется. Слой этилацетата промывается.при помощи 10 гал (37,85 л) деионизированной воды, фазам дают возможность разделиться и экстракты этилацетата концентрируются под ва = куумом до примерно 10 гал (37.85 л).

Лактонизация, Для того, чтобы осуществить циклизацию любого соединения IV в экстракте в соединение II производится следующая азеотропная обработка.

Экстракты этилацетата из дополнительных 300 гал (1 f 35,5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (f13 5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (113,5 л) при помощи вакуумной

253432 12

25

55 дистилляции. Добавляется примерно

50 гал (189 .л) толуола и содержимое концентрируется под вакуумом до объема 32 гал (121 л), эта стадия повторяется. Затем добавляется достаточное количество нового толуола, чтобы довести объем до 75 гал (284 л). Без использования вакуума содержимое доводится до дефлегмирования и это состояние поддерживается в течение 2 ч при температуре более 106 С.

Этот раствор далее концентрируется под вакуумом до небольшого объема, который затем концентрируется до маслянистого остатка в большом роторном испарителе под вакуумом.

Хроматография на силикагеле.

Полученные экстракты освобождают" ся от других растворителей добавлением 2 гал (7,5 л) метиленхлорида и повторной концентрацией до масла.

Маслянистый остаток растворяется примерно в 5 гал (18,9 л) смеси зтилацетат-метиленхлорид (30/70 об./об), а затем приготавливается шламм при помощи добавления 2,8 кг силикагеля.

Шламм наносится ровным слоем на верхнюю часть колонны из силикагеля с размерами 30,5 см 127 см, заполненную той же смесью растворителей.

Элюирование производится смесью этилацетат-метиленхлорид (40/60 об. /об.) co скоростью 800 мл/мин, Головной прогон составляет 10 гал (37,85 л), затем собираются фракции каждая объемом в 4 гал (15,141 л).

Фракции от 6 до 10 включительно концентрируются под вакуумом до маслянистого остатка, который растворяется в горячем этилацетате, обрабатывается обесцвеченным углеродом, фильтруется пока горячий и затем охлаждается. Кристаллы NSD 803 {соединение Х) выделяются фильтрацией, а маточные растворы концентрируются до масла и подвергаются хроматографии.

Повторная хроматография на силикагеле.

Остаточные маточные растворы иэ одного и того же экстракта бульона, эквивалентные по производительности дополнительным 600 гал (2271 л) сырья для ферментации, соединяются в соответствии с приведенным в растворе метиленхлорида. Половина этого раствора используется для дальней13 12534 шей хроматографии на силикагеле, Исследование небольшой порции показывает, что общее содержание твердых частиц составляет 325 r. Раствор обрабатывается 40 г обесцвеченного уг. лерода, фильтруется .и лепешка промывается метиленхлоридом. Соединенные фильтрат и промывочные растворы концентрируются под вакуумом до маслянистого остатка. Остаток вновь растворяется в 800 мл смеси этилацетат-метиленхлорид (30-70 об./об.) и раствор превращается в шламм добавлением 225 r силикагеля. Шлаки загружается в верхнюю часть слоя силн- 11 кагеля колонны с размерами 14 35 см, заполненной той же смесью растворителей. Проявление осуществляется смесью этилацетат-метпленхлорид (40/60 об./об.), Головной прогон, составляющий 3 л, сбрасывается, а затем собираются фракции объемом

800 мл каждая.

Хроматография при обращенно-фазовом заполнении. 25

40 мл из 12 фракциии хроматографической процедуры концентрируется до масла весом 500 мг и затем масло вновь растворяется в 5 мл ацетонитрига. Этот ацетонитрильный раствор загружается в хроматографическую ко.— лонну из нержавеющей стали с размерами; внешний диаметр 1,59 см, длина 1,8 и, заполненную препаративной обращенной фазовой жидкостью для колонн хроматографии Бондапак С 18/По35 разил В. Колонна элюируется смесью, содержащей 55% об. /об. ацетонитрила и 457 и 0,05 И раствора фосфата аммония, рН 3. Объем элюирования между 1360 и 1700 мл собирается на

49 основе исследования показателя преломления. Органический растворитель удаляется под вакуумом и остаточный водный раствор экстрагируется этил45 ацетатом. После удаления под вакуумом этилацетата остается 120 мг соединения, которое кристаллизуется из концентрированного ацетонитрилового раствора, в результате чего

50 образуются кристаллы NSB 883 (соединение II) т.пл. 129-131 С, молекулярный вес 406, найдено при помощи спектроскопии 406, 2706, рассчитано 406, 27!9.

Оптическое вращение.

Характерное оптическое вращение

25 о (3 = 148.6 определяют на раство32

14 ре 5,23 мг/мл СН,CN. Это значение получено при помощи измерения длины волны линии натрий-D. з

С ЯМР химические сдвига (CDCIэ)у ррм

11,8; 14,9," 16,5, 21,1; 23,1;

35,9, 37,4; 48,5; 38,6; 41,9 (2С);

62, 3; 70, 1; 76,5; 131, 0; 132,6, 171 2 и 176,7.

На основании этих и других данных можно предположить, что продукт име— ет следующую химическую стереоструктуру

Но 0

/А/ ф ф

СИЗ Н

Соответствующие оксикислоты (соединение IV) тогда имеет структуру

НО CQOH он ! Н

Пример 4 ° Ингибирование в пробирке редуктазы НИС кофермента A.

Используется модифицированный метод Бега. Модификация заключается в инкубировании фермента с ингибитором в течение 5 мин перед инициированием реакции с субстратом. При работе с такими сильными ингибиторами, какими являются новые соединения, стандартная процедура, в соответствии с которой фермент добавляется только в смесь ингибитор-суб" страт, дает нелинейную кинетику.

Используя модифицированную процедуру, соль натрия соединения IV дает показатель ХС„ ингибирования редуктазы HNG-CoA, равный 2,7» 10 И, по сравнению с 5,4 10 И для соединения М?. 236 В.

Ингибирование в реальных условиях синтеза холестерина (соединение II).

Составитель В. Романова

Техред В. Кадар Корректор М. Поко

Редактор H. Бобкова

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4635/60

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

15 1

Нескольким группам самцов крыс

Голтцмана вводится либо 5Х эмульфор в соляном растворе, либо испытываемое соединение в эмульфоре через трубку, введенную в желудок. Спустя

1 ч вводится ВП 80 NCi С ацетата/

/кг. Затем спустя 50 мин производится анализ крови крыс и определяется и содержания С холестерина, как меры синтеза холестерина:

Доза, мг/кг Ингибиравание,Ж

0,15 38

0,6 51

1:2 70

Пример 5. Сравнение соединений I, II u NL-236В, как ингибиторов синтеза холестерина в клеточной культуре .

Используется модифицированная процедура А. У. Албертса и др. для измерения количества биосинтезированного С холестерина из мС уксусной кислоты в клетках мьппей

253432

16

L-М в культуре. Испытуемое соедине ние в 10 мкл диметилсульфоксида добавляется в монослойные культуры с

5 1: ацетата. После 3 ч инкубиро!

5 вания клетки омыляются и С холестерин экстрагируется и выделяется при помощи тонкослойной хроматографии на снликагеле с исполъзова" нием смеси петролейный эфир — диэтиловый простой эфир-уксусная кислота (75:25:1). Область на аласf4 тинке, содержащая С холестерин, устанавливается с использованием еетавляющего пятна на этой области I, 15 и содержаний С определяется ри

f4 помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика, При помощи этой модифицированной процедуры устанавливается, что сое20 динение ТХ дает значение ХС для ингибирования редуктазы НИО-СоА, равное 17 нм, по сравнению с 22 нм для соединения E и 46 нм для соединения МЬ-236В.