Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 C 12 N 1/00, С 12 q 1/00 CI 2 1 00 С 12 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1.д

К АВТОРСКОМУ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3774503/28-13 . (22) 20.07.84 (46) 30.08.86. Бюл. Р 32 (71) Институт микробиологии и виру-, сологии АН КазССР (72) А,H.Èëÿëåòäèíîâ, С.А.Абдрашито.ва и С.А.Айткелъдиева (53) 576,8.093.1(088.8) (56) Романенко В.И., Кузнецов С.И., Экология микроорганизмов пресных вод. И.: Наука, 1974. (54) (57) СПОСОБ ВЬ1ПЕЛЕНИЯ ИИКРООРГАНИЗИОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОЛИРЕДУКТАЗНЫКИ

СВОЙСТВАМИ, ИЗ ПРИРОДНЫХ СУБСТРАТОВ, .,Я0„„1253999 A1 включающий получение накопительной культуры в анаэробных условиях, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени выделения микроорганизмов — полиредуктантов, после получения накопительной культуры осуществляют ее посев на рыбопептонный агар и ведут культивирование в аэробных условиях, после чего выделяют чистые культуры микроорганизмов и проводят их посев на питательные .среды для выявления способности полученных культур к сульфатредукции и нитритообразованию.

° .

Изобретение относится к области микробиологии.

Цель изобретения — сокращение времени выделения микроорганизмовполиредуктантов.

Сущность способа заключается в следующем. Исследуемую пробу высевают в 3-5 параллельнык рядов пробирок, которые затем доверху заливают средой накопления (среда Штурм) и закрывают резиновыми пробками.

Среда иаконления имеет следующий состав дистиллированной воды, г/л:

Лактат кальция

Аммоний сернокислый

Фосфат калия, однозамещенный

Сульфат магния

Сульфат кальция

Соль Мора

1 .-нъ|й раствор сульфида натрия

1,0

0,5

1,0

0,5

0,5

1 мл

Все выросшие на РПА колонии выделяют в чистой культуре на скошенный РПА и затеи проверяют их способность к восстановлению нитратов и сульфатов. Суспензвю чистых культур высевают в среду для выращивания факультативно-анаэробных денитрифицирующих микроорганизмов (среда Гильтая) следующего состава дистиллированной воды, г/л:

Ю

Аспарагин 0,5

Глюкоза 10 О

Нитрат калия 2,0

Натрий лиммонHq-кислый .2,5

Фосфат калия, однозамещенный 2,0

Сульфат магния 2,0

Хлористый кальций 0,2

Хлорное железо Следы

Бромтимолблау 0,1%

Изменение окраски среды от зеленоватой до синей через неделю инкубации, происходящее при подщелачива- !

Через 10-14 дней инкубации при

;28 С, когда визуально наблюдают по- ернение среды, свидетельствующее о наличии процесса сульфатредукции, производят посев среды из накопительной культуры в чашки Петри на поверхность рыбопептонного агара (РПА) в 10-20 кратной повторности.

3,5

Лактат кальция

Сернокислый аммоний

Фосфат калия, однозамещенный

Сульфат магния

Сульфат кальция

Соль Мора

1%-ный раствор сульфида натрия

Агар

1,0

0,5

0,5

0,5

0,5

1 мл

15-20

0 развитии процесса сульфатредукции,судят по образованию черных колоний в толще агаризованной среды.

Наличие роста на всех предлагаемых средах с образованием соответствующих восстановленных продуктов (нитрит-иона, газообразного азота, сероводорода) указывает на возможность проявления выделенными культурами микроорганизмов полиредуктазных свойств. С отобранными таким образом штаммами микроорганизмов проводят ряд.5-10 кратных перекрестных пе,ресевов на указанные среды в соответствии со схемой.

Способность чистых культур мик роорганизмов развиваться на всех ,1б предлагаемых средах в течение ряда перекрестных пересевов и осуществлять на соответствующих средах восстановление кислорода, нитратов или сульфатов указывает, что выделенный 5 .штамм обладает полиредуктазными свойствами.

Способ поясняется конкретным. примером.

Пример, Из почвы и шахтных вод местсрождения стерильно отбирают пробы, каждую из которых затем .высевают в 5 пробирок с жидкой срет-. дой Штурм для получения накопительной культуры в анаэробных условиях.

Количество инокулята составляет 5-

10% от общего объема питательной среды. нии среды и появление иона 110 - (о чем судят по порозовению среды при добавлении реактива Грисса), свидетельствует о наличии процессе денит5 рификации.

С колонии íà PIIA делают также посев на агаризованную среду для сульфатредуцирующих микроорганизмов

{среду Штурм) следующего состава дистиллированной воды, г/л:

1253999

Пробирки закрывают резиновыми . пробками так, чтобы в пробирке не осталось пузырьков воздуха и инкубио руют в термостате при 28 С. Через

1О дней, если в пробирке наблюдается почернение среды, обусловленное развитием микроорганизмов, восстанавливающих сульфаты с образованием сероводорода, из полученной наколительной культуры делают высев на ры- 1О бопептонный агар и 5-10 чашек Петри

H культивиро. ание ведут в аэробных условиях .в течение трех суток. В этих условиях происходит гибель всех олигатно-анаэробных микроорганизмов, 15 в частности сульфатредуцирующих бактерий. На чашках Петри обычно вы-. растает небольшое количество колоний, которые выделяют в чистой культуре на скошенньш рыбопептонный агар 2О

Чистые культуры микроорганизмов высевают в 5 пробирок со средой Гильтая для проверки их денитрифицирующей способности и в 5 пробирок в ана- эробные условия ..на агаризованную среду Штурм.

Через 10 дней наличие роста в анаэробных условиях, появление серо30. водорода на среде Штурм, а также обнаружение нитритов в среде Гильтая свдетельствует о выделении микроор, ганизмов — полиредуктантов. В качестве контроля используют среды, не засеянные микроорганизмами. 35

Исследование 50 образцов воды, почвы и руды позволило выделить 4 штамма микроорганизмов, обладающих полиредуктазными свойствами.

Выделенные культуры микроорганизмов были идентифицированы по определению Берги как аэробные формы, относящиеся к семейству Рзецдошоопа

daceae роду Pseudomonas и видам

Ps s tutzeri H Ps endocina. Так как 45 культуры отличались от описанных в определителях Берги и Скермана рядом новых свойств, в частности способностью редуцировать сульфаты, к видивому названию культуры было добав- 50 лено название варианта var. desulfurican

Выделенные микроорганизмы отличались некоторыми культурально-морфо= логическими свойствами и поэтому S5 были разделены на две группы, s одну из которых вошли штаммы 18 и 126-4, а во вторую — 28 и 39в-4.

Описание изученных культур микроорганизмов: Pseudomonas stutzeri var.

desulfuricans 18 — грамотрицательная, подвижная, неспорообразующая палочка, размеры которой 2 " 0,5-0,7 мкм.

На РПЛ колонии вырастают округлой формы, диаметром 5-6 мм коричневого цвета, блестящие, гладкие. Имеют один жгутик. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5. Температурный оптимум 25-30"С, но может расти и при

42 С. При 4 С роста нет. На мясопеп-. тонном бульоне образует скудныи осадок, слабо выделяет МЯ и Н Б.

Протеолитической способностью йе обладает, гидролизует крахмал, молоко не пептонизирует и не гидролизует.

Оксидазоположительна. Хемоорганотрофна. Способна расти аэробно на рыбопептонном arape. В качестве источника азота в аэробных условиях используют мочевину, пептон, асларагин.

В качестве единственного источнчка углерода.в азробных условиях использует глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, сахароэу, мальтозу, декстрозу, глицерин, сорбит, маннит, этанол. Иикроаэрофил при росте в аэробных условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих ОВП среды — мочевины, сульфида натрия.

В анаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, ацетат, глюкозу. B присутствии переменновалентных элементов (ИО, Fe ь, As т

S0 ) растет на глюкозе, ацетате, 4 лактате, пирувате. В отсутствии

5+ + ионов N0>, As, Fe — на лактате, 1пирувате, ацетате. Беэ ионов SOq рост не наблюдается.

Способна восстанавливать 0,850,94 мг/мл нитратов до 120 мг/мл сульфатов. Не может осуществлять брожение с образованием газообразных продуктов в анаэробных условиях в присутствии глюкозы. Содержание Г+Ц в ДНК 62,5 мол.7. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен из шахтных вод

Бакырчикского месторождения.

Pseudomonas stutzeri var. desulfuricans i26-4 по большинству показателей выделенный штамм сходен с описанным выше Ps. stutzeri var.

desu7furicans 18. Отличительными являются следующие свойства: штамм

126-4 имеет размеры 1,5v0,4-0,6 мкм.

12539

Составитель В.Голимбет

Техред И.Попович Корректор М.Максимишинец

Редактор Ю.Середа

Заказ 4686/28 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж--35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-поли рафическое предприяите, г.ужгород, ул.Проектная, 4

В качестве единственного источника углерода не использует глицерин, декстрозу, сорбит и этанол, Выделен из лечебной грязи озера Балпаш-Сор.

Pseudomonas mendocina var. desuJfuricans 28 — грамположительная, неспорообразующая палочка, имеющая размеры 1х0,4-0,5 мкм. На рыбопептонном агаре колонии вырастают беловатые, гладкие, блестящие, округлой 10 формы. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5, температурный оптимум 25-30 С но может расти и при

42 С ° При 4 С роста нет. На мясопептоином бульоне образует плотный 15 обильный осадок, выделяет NH> и Н S, протеолитической способностью не обладает,", гйдролиэует крахмал. Расщепляет жиры, свертывает молоко. Оксидазаотрицательна. Хемоорганотрофна. 20

Способна расти аэробно на рыбопептонном агаре. В качестве источника азота в азробных условиях использу— ет мочевину., пептон, аспарагин. В качестве единственного источника угле- 25 рода в аэробных условиях использует арабинозу, глюкозу, ксилоэу, рамнозу, фруктоэу, галактозу, сахарозу, лактоэу, рафинозу, декстрозу, глицерин, сорбит маннит. При росте в аэробных gg условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих

ОВП среды — мочевины, пептона, сульфйда натрия.

В аиаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, глюкозу, ацетат. Независимо от присутствия н среде ионов переменновалеитных металлов (NO, As, Fe . SG ) хо99 4 рошо растет в анаэробных условиях йа глюкозе, пирувате, ацетате.

Способна восстанавливать 0,870,94 мг/мл нитратов и до 30 мг/л . сульфатов. В среде с глюкозой в анаэробных условиях осуществляет брожение с образованием газообразных продуктов. Содержанке Г+Ц в ДНК 51,7

51,7 мол.X. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен иэ шахтных вод Бакырчикского месторождения Pseudomonas

mendocina var. аеас furicans 39 в-4ло большинству признаков выделенная культура микроорганизмов также сходна с Ps. mendocina var. desulfuricans 28. Но имеются следующие отли" . чительные признаки. Штамм 39в-4 имеет размеры клеток 1 0,3-0,4 мкм. В качестве единственного источника углерода использует мальтоэу, дульцит и глицерин. Штамм 39в-4 обладает слабой протеолитической активностью и слабо разжижает желатин.

Выделен из воды канала ИртышКараганда.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить в течение

25-30 дней представителей новой группы микроорганизмов, способных в анаэробных условиях восстанавливать ряд переменно валентных элементов и расти в аэробных условиях, в то время как, используя общепринятые методы, поиск микроорганизмов — полиредуктактов по проверке всех выросших на РПА колоний микроорганизмов к способности к полире-„„ дукции, может занять неопределенно долгое время.

Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов 

 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в научно-исследовательской практике

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способам получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза непрерывным методом

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии и представляют собой рекомбинантные плазмидные ДНК, обуславливающие синтез производных соматотропного гормона человека (СТГЧ), способ конструирования данных рекомбинантных плазмидных ДНК и штаммы - продуценты производных СТГЧ, содержащие эти рекомбинантные плазмиды
Наверх