Композиционный материал для анионообменника и способ его получения

 

Изобретение относится к области химической технологии, конкретно к композиционному материалу для анионообменника и способу его получения. Изобретение позволяет придать анионообменнику высокую активность к белкам за счет того, что композиционный материал для анионообменника содержит в качестве носителя пористую двуокись кремния с поверхностью 1050 , пропитанную полимерным связующим , выбранным из группы: диэтиламиноэтилпроизводное крахмала, декстрана , агарозы или целлюлозы, при следующем соотношении компонентов, мас.%: полимерное связующее 3-20J носитель остальное и дополнительно 0,5-4 мас.% материала 1,4-бутандиолглицидилового простого эфира, эпихлорбромгидрина или диэпоксисоединения формулы СНз сн2-и:н- (CH2)(CH2V (Г 6 Получают композиционный материал пропиткой минерального носителя 1,5 10%-ным раствором полимерного связующего при рН 8,5-11,5 с последующей СО сушкой до постоянного веса при 50 120 С и обработкой 1,4-бутандиолглицидиловым простым эфиром, эпихлрр (бром)гидрином или диэтоксисоединением формулы Шз ю О5 (CH2h-N-№2VCH ;pH2 00 в количестве 0,5-4 мас.% материала. СЛ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИ ЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

И ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ1ТИЙ (21) 2712252/23-05 (62) 2384451/23-26 (22) 15.01.79 (23) 29.07.76 (31) 73094 (32) 29.07.75 (33) LU (46) 30.10.86. Бюл. Р 40 (71) Энститю Мерье (PR) (72) Жан-Луи Тэйо и Мишель Тарди (I R) (53) 661. 183. 12(088. 8) (56) Патент Великобритании

Ф 1043616, кл. С 1 А, опублик. 1966. (54) КОМПОЗИЦИОННЫИ МАТЕРИАЛ ДЛЯ

АНИОНООБМЕННИКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (57) Изобретение относится к области химической технологии, конкретно к композиционному материалу для анионообменника и способу его получения.

Изобретение позволяет придать анионообменнику высокую активность к бел— кам за счет того, что композиционный материал для анионообменника содержит в качестве носителя пористую двуокись кремния с удельной поверхностью 1050 м /г, пропитанную полимерным связующим, выбранным из группы: дизтил„ SU ÄÄ 1268105 А 5 (51) 4 С 08 L 1/26, 3/00, 5/ t 2, С 08 K 13/02//С 08 J 5/20 (С 08 К 13/02, 3:36, 5:04, 5:06, 5:16) аминоэтилпроиз водное крахмала, декстрана, агарозы или целлюлозы, при следующем соотношении компонентов, мас.%: полимерное связующее 3 — 20, носитель остальное и дополнительно

0,5-4 мас.7. материала 1,4-бутандиолглицидилового простого эфира, эпихлорбромгидрина или диэпоксисоединения формулы - 4 сн,- сн- (сщ,-4-(сн, - сн- сня

, О

Получают композиционный материал пропиткой минерального носителя 1,5—

107.-ным раствором полимерного связующего при рН 8,5-11,5 с последующей сушкой до постоянного веса при 50

120 С и обработкой 1,4-бутандиолгли-. цидиловым простым эфиром, эпихлор (бром)гидрином или диэтоксисоединением формулы

СН

1 снй сн (сн2Ъ N (сна сн W2 в количестве 0,5-4 мас.7. материала.

1268105

Пример 2. 10 r сфероэила

ХОВ 015 пропитывают при 65 С 20 мл

65%-ного раствора ДЭАЭ крахмала с рН 10 до получения следующего соотношения, мас.%: ДЭАЭкрахмал 13; ми, неральная окись остальное.

Смесь сушат в сушильной камере при 50 C в течение около 15 ч до по— лучения постоянного веса. Полученный порошок гомогенизируют, если необходимо, просеивают для удаления возможных алгомератов.

К пропитанному таким образом сфе ролизу добавляют 20 мл 0,4%-ного раствора 1,4-бутандиолдиглицеридэфи50

Изобретение относится к химичес,кой технологии, а именно к композиционному материалу для анионообменника и способу его получения, и может быть использовано при разделении и . 5 очистке белков.

Целью изобретения является придание материалу высокой активности к белкам.

Пример 1. К 10 r пористой

10 двуокиси кремния с удельной поверхнос. тью 50 м /г - сферозила ХОВ 030, пропитанного раствором диэтиламиноэтилдекстрана (ДЗАЭдекс тра на) при рН

11,5, в соотношении, мас.X: ДЭАЭдек- 15 стран 15 {30 мл 5%-ного раствора), минеральная окись — остальное,, а затем высушенного в печи с получением гомогенного порошка, прибавляют

20 мп 5%-ного раствора 1„4-бутандиол- 20 глицидилового простого эфира в диэтиловом эфире, смесь перемешивают при 40 С до полного испарения диэтилового эфира и достижения равномерной пропитки диэпоксидным соединением (0,5% от массы материала).

Для получения анионэобменника смесь доводят до 80 С и выдерживают при этой температуре 15 ч. После конечного просеивания сорбент вводят сухим в колонку, промывают 1 л

О, 1 н. раствора гидрата окиси натрия, затем 1 л 1 М раствора хлористого натрия, и приводят в состояние равно— весия при помощи применяемого при хроматографии буферного раствора.

Емкость сорбента при фиксации белков составляет 40 †2 мг на 1 r сорбента в зависимости от услсвий проведения хроматографии. При начальной пористости сорбента 10—

80 м /г эта емкость является постоянной. ра в этиловом эфире (0,8X от массы материала). Смесь непрерывно перемешивают при 40 С до полного испарения этилового эфира и получения равномер ь ной пропитки, затем доводят до 80 С в течение 15 ч. После просеивания носитель в сухом виде помещают в колонку, промывают 1 л О, 1 н. раствора щелочи натрия, затем 1 л 1 М раствора

NaCl и уравновешивают буферным раствором, применяемым для требуемого типа хроматографии., Емкость фиксации протеиHoв составляет 40-200 мг на 1 г носителя в зависимости от условий хроматографии.

Пример 3. 10 r сферозила

ХОС 005 (пористой двуокиси кремния с удельной поверхностью 10 м /г) пропитывают при 100 С 20 мл водного раствора ДЭАЭагароэы при рН 9 в следующем соотношении, мас.%: ДЭАЭагароза 12, минеральная окись остальное.

Смесь сушат в сушильной камере при

80 С в течение примерно 15 ч. Полученный порошок гомогенизируют и просеивают для удаления возможных агломератов. После пропитки к носителю дооавляют 20 мл раствора эпихлоргидрина или эпибромгидрина в этиловом эфире (0,6% от массы материала). Смесь о непрерывно перемешивают при 40 С до полного испарения этилового эфира и получения равномерного пропитывания этим сшивающим агентом, затем доводят до 40-120 С в течение около 15 ч.

Если необходимо, носитель просеивают, помещают в сухом виде в колонку,промывают 1 л 0,1 н. соды, затем 1 л

1 Мраствора NaC1 и уравновешивают буферным раствором, применяемым для данной хроматографии.

Емкость фиксации протеинов составляет 40-200 мл на 1 r носителя в sa> висимости от условий хроматографии .

Пример 4. К 10 r сферозила

ХОВ 030 (пористая двуокись кремния с удельной поверхностью 50 м2/г) добавляют 30 мп кетонового раствора ацетата целлюлозы с концентрацией

3% при комнатной температуре. Пропитанный носитель просушивают в потоке горячего воздуха, полученный порошок диспергируют в 1 л раствора щелочи натрия при температуре окружающей среды в течение f5 ч, что приводит к гидролизу сложного эфира целлюлозы и к регенерации исходной целлю— лозы.

1268105

Во второй стадии носитель, пропитанный таким образом целлюлозой, обрабатывают хлоргидратом хлортриэтиламина в щелочной среде с рН 10 цри 80 С. Состав материала, мас.7:

ДЭАЭцеллюлоза 9, двуокись кремния остальное.

После сушки в сушильной камере для получения однородного порошка добавляют 20 мл 0,47-ного раствора бутандиолдиглицеридэфира в этиловом эфире (0,87 от массы материала).

Смесь непрерывно перемешивают при

40 С до полного испарения этилового

Cl эфира, затем доводят до 120 С в течение около 15 ч. После просеивания носитель в сухом виде помещают в колонку, промывают 1 л О, 1 н. раствора щелочи натрия, затем 1 л 1 М раствора NaC1 и уравновешивают буферным раствором для хроматографии.

Пример 5. Отвешивают 10 г сферозила ХОВ 0 15 и пропитывают его при 55 С 20 мл раствора ДЭАЗагарозы концентрацией 1,57 с рН 9. Смесь высушивают в сушильной печи при 5055 С в течение примерно 12 ч для достижения постоянства веса.

После просеивания пропитанный материал имеет следующий состав, мас.X: ДЭАЭагароза 3, двуокись кремния остальное.

К 10 г пропитанного таким образом сферозила добавляют 20 мл раствора (концентрацией 0,57) диэпоксидного соединения формулы

СН сн;сн-(сн,,-4-(сн, -сн — сн, Г с" в этиловом эфире, что соответствует концентрации этого соединения 17 по отношению к пропитанному материалу.

Реакционную смесь перемешивают при 40 С до полного испарения этилового эфира. Затем температуру повышают примерно до 80 С в течение прио мерно 10 ч.

После просеивания носитель набивают в сухом виде в колонку, промывают 1 л О, 1 н. гидрата окиси натрия, а затем 1 л 1 M NaC1 и уравновешивают соответствующим буферным раствором, подходящим для хроматографии.

Пример 6. Отвешивают 10 г сферозила ХОС 005 и пропитывают его

20 мл 107-ного водного раствора

ДЭАЭкрахмала, нагретого до 75 С, рН 8,5. Затем смесь высушивают в сушильной печи при 80" С в течение 15ч.

Полученный порошкообразный продукт гомогенизируют и просеивают для удаления агломератов.

Пропитанный материал имеет следующий состав, мас.7.: ДЭАЭкрахмал 20, 10 двуокись кремния остальное.

К 10 г пропитанного таким образом сферозила добавляют 20 мл раствора эпибромгидрина концентрацией 27. в этиловом эфире, рН 8,5, что соответ1S ствует концентрации эпибромгидрина

47. по отношению к пропитанному сферозилу. Смесь непрерывно перемешивают при 40"С до полного испарения этилового эфира. Затем в течение

2а примерно 15 ч доводят температуру до 100 С.

После просеивания сухим носителем наполняют колонку, промывают 1 л

0,1 н. гидрата окиси натрия, затем

25 1 л 1 М ИаС1 и уравновешивают буферным раствором, подходящим для хроматографии.

Пример 7. Прямая очистка гамма-глобулинов из сыворотки или плазмы людей и животных.

Схема цикла для 50 г сорбента, приготовленного в соответствии с примерами, приведенными выше.

Приведение колонки в состояние рав. новесия буферным раствором с рН между

6,3 и 8, например 6,8 (буферный раствор РО 0,01 — 0,02 М или буферный раствор трис-НС1 0,05 М, или раствор хлористого натрия с концентрацией

1-3 г/л) со скоростью 200 мл/см ° ч.

Введение 50 (ч плазмы или сыворотки, предварительно диализованной против буферного раствора, применяемого при хроматографировании, и профильтрованной для устранения возможности кольматажа (средняя скорость подачи

50- 100 мл/см ч) . В случае сорбента, приготовление которого описано в примере 1, количество плазмы или сыворотки на один цикл должно быть снижено до 25 мл.

Промывание колонки буферным раствором, применяемым при хроматографировании.

Собирание выходного пика, состоящего из чистых гамма-глобулинов, чистота которых проверяется иммуно— электрофорезом, с выходом 50 †10

5 в зависимости от применяемых буферных растворов. Выход более высок при рН ниже 6,8 или при более высоких ионных силах, при этом возникает опасность, что продукт будет недостаточно чистым. Такое получение гаммаглобулинов освобождает их от пирогенных веществ и антигена, ассоциирующегося с гепатитом В (AgHBs), которые могут присутствовать в сыром исходном материале.

Злюирование других белков, удерживаемых в колонке, каким-либо буферным раствором с рН 4 или буферным раствором, применяемым при хроматографировании, с добавкой 10-60 г/л хлористого натрия, или же цитратным буферным раствором 0,05 М с рН 4-8.

Продолжительность цикла примерно

2 ч (при применении простой автоматики в. один день можно провести десяток циклов, т,е. выход при обработке близок к 10 л сыворотки или плазмы на 1 кг пористой неорганической окиси в день). 25

Пример 8. Удаление гемоглобина при очистке альбумина из плацентарной крови и концентрирование других белков.

Фракционирование плацентарной кро- б ви спиртом по методу Коха проходит через стадию осаждения массы глобулинов при рН 6,8 в среде 20-257 †но этанола. В этих условиях альбумин, некоторые альфа вЂ, альфа-2 глобулины и гемоглобин, по существу, остаются в верхнем слое раствора. Их собирают .путем центрифугирования на холоде, разбавляют равным объемом дистиллированной воды (для снижения концент- щ рации спирта), рН устанавливают на уровне между 6 и 7 и жидкость осветляют путем фильтрования через мембраны из сложных эфиров целлюлозы.

Схема цикла очистки на 50 г сор45 бента:

Приведение колонки в равновесное состояние при помощи буферного фосфатного раствора 0,01 М или трис-НС1

0,05 M с рН 6-7 (предпочтительно

6,5) при скорости подачи 200 мл/см ч.

Введение при средней скорости подачи 100 мл/см ч 1000 мл описанного выше и подлежащего очистке раствора.

Промывание колонки буферным раст вором, применяемым при хроматографии, при той же скорости подачи. ОчищенЬ ный гемоглобин удаляется из колонки при незначительной степени разбавления, в то время как другие белки, такие как альбумин„ остаются фиксированными на колонке.

Злюирование белков, фиксированных на колонке, в условиях, идентичных приведенным в примере 2, причем пик содержит концентрированные белки и практически лишенные гемоглобина.

Продолжительность цикла 4 ч.

Пример 9. Концентрирование раствора протеинов, разбавленных в спиртовой среде, и удаление спирта.

Фракционирование протеинов согласно методу Коха неизбежно приводит к повторному растворению спиртовых осадков во время осуществления различных стадий. Для этого предпочтительно сильно разбавить осадок, чтобы снизить остаточную концентрацию образующегося спирта. После этого необходимо, с одной стороны, удалить спирт, с другой стороны, концентрировать присутствующие белки. Зто, как правило, осуществляется путем концентрирования в вакууме, лиофилизации или диализа, но два последних способа либо весьма сложны, либо являются источником депирогенов. Поэтому предпочтительно использовать следующий простой, быстрый и экономичный способ.

Примером служит раствор альбумина с концентрацией 27., содержащий 107. спирта .

Схема цикла очистки и концентрирования на 1 кг < орбента:

Приведение в состояние равновесия при помощи 0,01 H фосфатного буферного раствора с рН 7, скорость подачи 200 мл/см,ч.

Введение спиртового раствора альбумина с рН 7 путем прибавления соляной кислоты или гидрата окисИ натрия в зависимости от начальной величины рН, средняя скорость подачи 100 мл/см ч. Таким образом, на этой колонке можно фиксировать 200 1 альбумина (либо 10 л раствора за цикл), если альбумин плохо фиксируется на колонке, следует лишь достаточно разбавить исходный раствор дистиллированной водой, чтобы снизить ионную силу среды.

Промывание дистиллированной водой, скорость подачи 200 мл/см ч и определение момента, когда альбумин не

1268105 выделяется и заканчивается удаление спирта.

Элюирование альбумина одним из следующих буферных растворов: 0,1 И раствор хлористого натрия или 0,05 M раствор цитрата с рН 6,8, при этом, как правило, конечная концентрация альбумина составляет примерно 10-127, удаление спирта является полным, выход при таком методе равен примерно 10

1007. Этот способ применим для всех белков, изоэлектрическая точка которых ниже 6,5. Если изоэлектрическая точка белков превышает эту величину, метод применим при условии, что рН 15 буферного раствора, используемого при хроматографировании, будет повы— шена.

Все примеси, присутствующие в этих белковых растворах, также могут 20 быть удалены при условии, что они являются электрически нейтральными (глюциды и полисахариды) или имеют положительный "-аряд того же типа, что и сорбент (катионы). Если примеси имеют отрицательный заряд, может произойти на сорбенте "конкуренция" с отрицательно заряженными белками, которые желательно фиксировать. В этом случае, если степень сродства 30 примеси к сорбенту меньше, чем степень сродства белка, и если раствор может быть разбавлен в достаточной мере водой для достижения ионной силы, совместимой с фиксацией белков 35 на сорбенте, можно произвести удаление даже анионов. Приведенный ниже пример иллюстрирует такое разделение.

Пример 10. Концентрирование и очистка альбумина в растворе каприлата натрия.

В методах фракционирования пользуют каприлат натрия для коагуляции всех белков, за исключением альбумина, который в присутствии каприлата остается в растворе. Примером служит раствор, содержащий 15 г/л альбумина и 3 г/л каприлата.

Схема цикла для 1 кг сорбента, приготовленного в соответствии с примерами 2 и 3 (при использовании сорбента, приготовление которого описано в примере 1, следует удвоить количество сорбента):

Приведение в равновесное состояние, с фосфатным буферным раствором 0,01 М, рН 6, скорость подачи 200 мл/см,ч.

Введение раствора альбумина и каприлата с рН 6 (в случае черезмерно высокой ионной силы разбавление водой), средняя скорость подачи

100 мл/см ° ч. В колонку можно ввести с примерно 8 л раствора.

Промывание колонки буферным раствором, используемым при хроматографировании, до тех пор, пока не прекратится выход каких-либо веществ из колонки.

Элюирование альбумина в соответствии с методом, изложенным в предшествующих примерах. При этом получают раствор, содержащий 10-207 альбумина,который после доведения его концентрации до 207. содержит меньше

2,5 г/л каприлата натрия. Общая продолжительность цикла составляет примерно 4 ч.

Из этого примера видно, что метод может быть распространен на очистку и концентрирование различных биологических молекул, имеющих отрицательные заряды при определенных величинах рН (нуклеиновые кислоты, белки, анионные поверхности, анионные гликолипиды) .

Возможность широкого применения метода и то, что колонка такого типа выдерживает без каких-либо последствий прохождение жидкостей самой раз— личной полярности, показано в следующем примере.

Пример 11. Концентрирование и очистка ганглиозидов из водных экстрактов мозга животных.

Ганглиозиды представляют собой гликолипиды, играющие важную роль в физиологии и патологии на уровне клеточных перегородок в качестве рецепторов и эффекторов. Они содержат большее или меньшее количество сиалиновой кислоты и поэтому при рН выше 3 заряжены отрицательно.

Из 1 кг бычьего мозга можно получить около 7 л водного экстракта.

Водные экстракты пропускают непосредственно через колонку из

50 r сорбента, изготовленного по примеру 3, предварительно приведенного в равновесное состояние при помощи буферного раствора трис — НС 3 0,05 M рН 6,8. Скорость подачи 200 мл/см2 ч.

Все ганглиозиды в этих условиях фиксируются на колонке. Производится предварительное промывание следующими материалами в указанной последо1268105.

10 в количестве 0,5-4 мас.X материала.

Составитель Т.Мартинская

Техред А.Кравчук Корректор Г.Решетник

Редактор И.Рыбченко

Заказ 5836/60 Тираж 470 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4 вательности: TpHc HC i 0,05 Nó PH 6 8, О, 1 н. раствор гидрата окиси натрия, вода, хлороформ-метанол-вода в объемных соотношениях 30:60;25, что позволяет удалить многочисленные примеси.

После этого производится элюирование ганглиозидов в концентрированной и очищенной форме при той же скорости подачи при помощи смеси 10 хлороформ-метанол — О, 1 н. соляная кислота в объемных соотношениях

30:60:25.

После проведения элюирования собранный пик нейтрализуют путем прибав- 15 ления О, 1 н. раствора гидрата. окиси натрия, выпаривают и растворяют в какой-либо хроматографической системе для анализа. Выход 100K. Колонка может переходить от органического 20 растворителя к водному раствору и наоборот. Это может быть использовано для того, чтобы исключить необходимость в очистке колонки, или для то—

ro, чтобы поддерживать в колонке сте- 25 рильные условия. формула изобретения

1. Композиционный материал для 30 анионообменника на основе пористого минерального носителя и полимерного связующего, отличающийся теМ, что, с целью придания материалу высокой активности к белкам; он 35 содержит в качестве минерального носителя пористую двуокись кремния с удепьной поверхностью 10-50 м /г, а в качестве полимерного связующего— диэтиламиноэтиловое производное крах-40 мала, декстрана, агарозы или целлюлозы при следующем соотношении компо— нентов, мас.7:

Диэтиламиноэтиловое производное крахмала, F декстрана, агар озы или целлюлозы 3-20

Пористая двуокись кремния Остальное и дополнительно 0,5-4 мас.7 материала 1,4-бутандиолглицидилового простого эфира, эпихлор(бром)гидрина или диэпоксисоединения формулы

СН ! 1 сн,-сн-(сн, -н-(сн -сн — рн

2. Способ получения композиционного материала для анионообменника обработкой минерального носителя полимерным связующим, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью придания материалу высокой активности к белкам, в качестве минерального носителя используют двуокись кремния с удельной поверхностью 10-50 м /г, в качестве связующего — диэтиламиноэтилпроизводное декстрана, крахмала, агарозы или целлюлозы, а обработку проводят пропиткой 1,5-10Х-ным раствором связующего при рН 8,5- 11,5 с последующей сушкой до постоянной массы при 50-120 С и дополнительной

9 обработкой 1,4-бутандиолглицидиловым простым эфиром, эпихлор(бром) гидрином или диэпоксисоединением формулы НЗ

1 сн,— сн-(сн,(,-к-(сн, -сн — н

"0 о