Способ мутагенеза escherichia coli

Авторы патента:

C12N15/90 - стабильное введение чужеродной ДНК в хромосому

(19)SU(11)1271075(13)A1(51) МПК ⁵ _C12N15/90(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ МУТАГЕНЕЗА ESCHERICHIA COLI

Изобретение относится к области молекулярной генетики и генетической инженерии и может быть использовано для мутагенеза и маркирования ДНК хромосомы и плазмид бактерий. Целью изобретения является расширение числе реципиентных штаммов за счет снятия ограничений по генотипу amber⁺, ( ) , ^R . Поставленная цель достигается тем, что вносят транспозон Tn5 с помощью конъюгативной чужеродной неспособной к существованию в клетках E. coli плазмиды pJB5JI. Способ осуществляют следующим образом. Проводят скрещивания донорных бактерий Rhizobium, несущих конъюгативную плазмиду pJB5JI с транспозоном Tn5, с реципиентными бактериями E. coli и отбирают устойчивые к канамицину K_m-R клоны, являющиеся потомством бактерий E. coli с транспозоном Tn5 в составе их генома. П р и м е р 1. Бактерии штамм R. leguminosarum 897 (T) (phe, trp, str, pJB5JI) - донор и E. coli HB101 (leu, pro, lac, gal, thi, str, recA, r^-, m^-) - реципиент подращивают в течение 13 ч при 30^оС в жидкой полноценной среде МК, смешивают в соотношении 5: 1 (донор: реципиент), осаждают центрифугированием, переносят на поверхность агаризованной среды МК и инкубируют в течение 15 ч при 30^оС. Далее бактерии смывают стерильным буфером, высевают на агаризованную богатую среду LB c 30 мкг/мл канамицинсульфата K_m и выращивают при 37^оС. На среде LB бактерии донора R. leguminosarum 897 (T) не растут; в таких условиях вырастают только K_m-R бактерии E. coli, содержащее транспозон TnS. П р и м е р 2. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут штамм E. coli BH101 ^R. По- лучены K_m-R клоны бактерий Е. coli, содержащие транспозон Tn5. П р и м е р 3. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут E. coli К12 (). Получены K_m-R клоны бактерий E. coli, содержащие транспозон Tn5. П р и м е р 4. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве бактерий берут E. coli W3350 (amber-). Получены K_m-R клоны бактерий E. coli, содержащие Tn5. П р и м е р 5. Способ осуществляют как в примере 1, но в качестве реципиентных бактерий берут E. coli S17P (pro, res, recA, [RP4 (Tc: Mu) (K_m: Tm7)] pSVP 202 и конъюгационную смесь высевают на среду LB, содержащую 30 мкг/мл канамицинсульфата и 10 мкг/мл тетрациклина. Выросшие клоны бактерий далее скрещивают со штаммов E. coli ВН 101 для поиска вариантов, несущих pSVP202: Tn5 плазмиду (отбор на среде LB со стрептомицином (200 мкг/мл) и канамицинсульфатом (30 мкг/мл). Получены плазмиды pSVP202: : Tn5. Примеры 1-4 иллюстрируют возможность эффективного внесения транспозона Tn5 с помощью плазмиды pJB5JI в ДНК хромосомы различных штаммов E. coli. Частота появления K_m-R бактерий в этих примерах примерно одинакова и составляет величину (1-5) x 10^-5 на клетку реципиента. В параллельных контрольных экспериментах K_m-R мутантов спонтанного происхождения у использованных штаммов E. coli нет (частота ниже 1 x 10^-9). Проверка Km-R бактерий E. coli (по 12 клонов из каждого примера) с помощью модифицированного метода Экхардта показала, что плазмиды pJB5JI в клетках нет. Не удалось также перенести свойства K_m-R из этих бактерий в K_m-S штаммы E. coli или R. leguminosarum путем скрещивания. На этом основании предполагается, что плазмида pJB5JI в клетках E. coli существовать не может и K_m-R клоны возникают вследствие транспозиции с нее Tn5 транспозона в ДНК хромосомы реципиентных бактерий E. coli. Данное предложение подтверждается фактом выделения из K_m-R клонов бактерий ауксотрофных мутантов и возможностью перетранспозиции K_m-R признака. Из каждого скрещивания (примеры 1-4) отбирают и проверяют на ауксотрофность 500-600 K_m-R клонов бактерий E. coli. Во всех случаях находят различные ауксотрофные мутанты (по основаниям нуклеиновых кислот и аминокислотам) с частотой около 1% . С такой же примерно частотой Tn5 индуцирует образование ауксотрофных мутантов у водородных бактерий и с несколько меньшей - у ризобий. В один из выделенных K_m-R, ade-мутантов E. coliz К12 (пример 3) переносят трансмиссибильную плазмиду pPHJI и далее в скрещиваниях с E. coli С600 определяют частоту перетранспозиции на нее K_m-R признака. Эта частота равна 1 x 10^-5, т. е. характерна для перетранспозиции Tn5. П р и м е р 5 иллюстрирует возможность эффективного введения транспозона Tn5 в плазмиды E. coli. Берут реципиентный штамм E. coli S17P (pro, res, recA [RP4 (Tc: : Mu) (K_m: : Tn7) с плазмидой pSVP202 (pBR325, несущая oriT фрагмент мол. м. около 2 млн дальтона из RP4). Плазма pSVP202 мультикопийна и в данном штамме E. coli высокотрансмиссибильна. Введение в нее транспозона Tn5 можно легко детектировать по увеличению молекулярной массы и 100% -ному переносу плазмидой в скрещиваниях с другими штаммами E. coli признака K_m-R. В скрещиваниях R. leguminosarum 897 (Т) с E. coli S17P гибридные плазмиды pSVP202: : Tn5 находят в 5-10% образующихся Km-R клонов бактерий E. coli. (56) De Bruijn F. T. , Lupski L. R. The use of transposon Tn5 mutagenesis in the rapid generation of correlated physical and genetic maps of DNA segments cloned into multicopy plasmids. - A review Gene, 1984, v. 27, N 2, p. 131.

Формула изобретения

СПОСОБ МУТАГЕНЕЗА ESCHERICHIA COLI, включающий внесение траспозона Tn5 в реципиентные клетки с последующим отбором полученных мутантов по устойчивости к канамицину, отличающийся тем, что, с целью расширения числа реципиентных штаммов за счет снятия ограничений по их генотипу amber^t(

) ,

^R , внесение Tn5 осуществляют с помощью плазмиды pJB5JI.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологической промышленности

Способ получения инсерционных мутаций // 2237715

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения инсерционных мутаций в случайных или псевдослучайных положениях в хромосомной или внехромосомной нуклеиновой кислоты клетки-мишени

Способ определения активности транскрипционных факторов // 2520083

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения активности транскрипционных факторов. Изобретение может использоваться в фармакологии для первичного скрининга кандидатных соединений. Способ включает получение стабильно трансфицированных клеток линии HeLa путем введения в их хромосому плазмидного вектора pBI/neo/X (X - любой транскрипционный фактор эукариот), содержащего минимальный промотор цитомегаловируса человека, ген зеленого флуоресцирующего белка, последовательность нуклеотидов, кодирующих сайт связывания транскрипционного фактора, ген устойчивости к неомицину. Определяют активность транскрипционного фактора путем измерения интенсивности витальной флуоресценции полученной культуры клеток в присутствии тестируемого вещества в сравнении с интактной культурой клеток. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой чувствительностью определять активность транскрипционных факторов эукариот. 2 ил., 1 пр.

Продуцирующие антитела млекопитающие, не являющиеся человеком // 2559524

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено трансгенное животное, представляющее собой мышь или крысу, в геном которого встроена нуклеиновая кислота, кодирующая перестроенную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с константной областью иммуноглобулина указанного животного и функционально связанную с промотором, обеспечивающим экспрессию трансгенной легкой цепи в В-клетках млекопитающего, таким образом, что она образует пары с различными эндогенными тяжелыми цепями, обеспечивая получение антител. Также рассмотрены способы получения антител с использованием трансгенного животного, В-клетка трансгенного животного, применение животного и его В-клетки для получения антител и способ получения трансгенного животного по изобретению. Данное изобретение позволяет продуцировать антитела, содержащие легкую цепь с вариабельной областью иммуноглобулина человека в паре с различными тяжелыми цепями иммуноглобулинов животного. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 27 ил., 11 табл., 22 пр.

Гуманизированные il-6 и рецептор il-6 // 2634417

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии, в частности к генетически модифицированным животным семейства мышиных, а именно к мышам и крысам, которые экспрессируют IL-6 человека и дополнительно могут экспрессировать гуманизированный IL-6Rα. Указанное животное несет замену своего гена, кодирующего IL-6, в его эндогенном локусе IL-6 на ген человека, кодирующий IL-6 человека, и дополнительно замену последовательности, кодирующей внеклеточный домен IL-6Rα животного, в его эндогенном локусе IL-6Rα, на последовательность, кодирующую внеклеточный домен IL-6Rα человека, с получением гуманизированного гена IL-6Rα. При этом ген человека, кодирующий IL-6 человека, и гуманизированный ген IL-6Rα находятся под контролем эндогенных регуляторных элементов указанного животного в его эндогенном локусе IL-6 и IL-6Rα соответственно. Указанный гуманизированный ген IL-6Rα содержит эндогенные трансмембранную и цитоплазматическую последовательности IL-6Rα указанного животного. Изобретение также раскрывает способ получения указанных животных и выделенные эмбриональные стволовые клетки для получения таких животных. Изобретение позволяет получать трансгенных указазных мышей и крыс без каких-либо патологий. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл., 3 пр.

Система полицистронной экспрессии для бактерий // 2644346

Настоящие изобретения относятся к полицистронной экспрессии у грамположительной бактерии и касаются молочнокислой бактерии для экспрессии одного или нескольких экзогенных генов, фармацевтической композиции, содержащей такую молочнокислую бактерию, нуклеиновой кислоты и вектора. Представленная молочнокислая бактерия содержит единицу полицистронной экспрессии, причем указанная единица полицистронной экспрессии содержит эндогенный по отношению к указанной молочнокислой бактерии ген (эндогенный ген) и один или несколько экзогенных по отношению к указанной молочнокислой бактерии генов (экзогенные гены), причем указанный эндогенный ген и указанные один или несколько экзогенных генов находятся под транскрипционным контролем промотора, эндогенного по отношению к указанной молочнокислой бактерии. Изобретения обеспечивают высокие уровни экспрессии гетерологичных белков и могут быть использованы в медицине. 6 н.п. и 46 з.п. ф-лы, 23 ил., 8 табл.,16 пр.

Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами // 2645475

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу модификации целевого геномного локуса путем гомологичной рекомбинации в мышиной эмбриональной стволовой (ES) клетке. Для осуществления указанного способа сначала в мышиную ES-клетку вводят цинковопальцевую нуклеазу (ZFN), которая осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и большой нацеливающий вектор (LTVEC). Затем осуществляют отбор целевой мышиной ES-клетки, содержащей нуклеотидную вставку в целевом геномном локусе. При этом интеграция приводит к делеции эндогенной нуклеотидной последовательности в целевом геномном локусе и замене нуклеотидной. Указанный LTVEC содержит нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом, при этом нуклеотидная вставка составляет от около 5 т.н. до около 30 т.н. и общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность нацеливания путем применения LTVEC с ZFN по сравнению с применением только LTVEC. 35 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 1 пр.