Способ очистки трипсина

 

Изобретение относится к биотехнологии . Цель изобретения - повьшение активности целевого продукта. На колонку , заполненную сорбентом 1,6-диамингексан-целлюлозы , уравновешенную фосфатным буфером с рН 6,0-6,2, наносят экстракт из пилорических придатков кеты. Промывание колонки проводят фосфатным буфером. Десорбцию целевого продукта осуществляют 2830% изопропиловым спиртом, содержащим 1-1,5% NaCl. Полученный препарат содержит чистый трипсин, гомогенньй при электрофорезе в полнакриламидном б геле. 2 табл. (О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

° ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3842016/31-14 (22) 16.01.85 (46) 30.11.86. Бюл. ¹ 44 (71) Институт биохимии им. А. В. Палладина, Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, Институт физической химии им. А. В. Писаржевского и Киевский государственный университет им. Т. Г. Шевченко (72) С. А. Кудинов, M. В. Колодэейская, Т. Н. Пивненко, А. П. Мелешевич, И. П. Федорова, В. Н. Акулин, Л, M. Эпштейн и Н. Д. Морозова (53) 615.362.342.4(088,8) „„Я0„„1273392 А1 (59 4 C 12 N 9/76 А 61 К 35 39 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРИПСИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения — повышение активности целевого продукта. На колонку, заполненную сорбентом 1,6-диамингексан-целлюлозы, уравновешенную фосфатным буфером с рН 6,0-6,2, наносят экстракт из пилорических придатков кеты. Промывание колонки проводят фосфатным буфером. Десорбцию целевого продукта осуществляют 28ЗОЖ изопропиловым спиртом, содержащим 1-1,5Х NaC1. Полученный препарат содержит чистый трипсин, гомогенный при электрофорезе в полиакриламидном геле. 2 табл.

1273392

Изобретение относится к медицине, в частности биотехнологии, к способам получения протеолитических ферментов °

Цель изобретения — повышение активности целевого продукта, Поставленная цель достигается за счет использования определенного режима экстракции, а также хроматографии на l,б-диамингексан-целлюлозе, 10 при этом десорбцию целевого продукта осуществляют смесью 28-ÇOX изопропилового спирта и 1,0-1,5 NaC1, Пример 1. Получение биоспецифического сорбента (1,6-диамингек- IS сан-целлюлозы).

Бумагу, фильтровальную или хроматографическую, облучают г -лучатся на кобальтовой установке или ускоренными электронами, поглощенная доза 20- 20

30 Урад при мощности дозы 50 0—

2 5-10 рад/с. После этого 50 r измельченной бумаги (lxl см) помещают

-в колбу емкостью 1 л с обратным холодильником, добавляют 6,2 r l,б-диаминогексана, растворенного в воде (количество ГМДА эквивалентно 3% альдегидных групп, содержащихся в

50 г облученной бумаги). Смесь кипятят в течение 3-х ч, охлаждают, бу- 30 магу многократно промывают водой до тех пор, пока рН промывных вод не будет равен 7,0. После этого бумагу отжимают, сушат. Полученный сорбент используют для очистки трипсина. 35

Пример 2, На колонку, заполненную 10 мл сорбента l 6-диамингексан-целлюлозы, уравновешенную

0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0> наносят 20 мг экстракта из пилори- 40 ческих придатков кеты (рН 6,0), растворенного в 2 мл дистиллированной воды. Эстеразная активность исходного препарата: 520 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ вЂ” тозил-L-аргинин метило- 45 вый эфир) — трипсиноподобная активность; 1620 ед/мг белка (субстрат

БТМЭ вЂ” бензоил-L-тирозин метиловый эфир) — химотрипсиноподобная активность, 50

Промывание колонки проводят

0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0.

Десорбцию целевого продукта осуществляют 28 -ным иэопропиловым спиртом, содержащим 1,0Х NaC1. SS

Полученный препарат содержит чистый трипсин, гомогенный при; электрофорезе в полиакриламидном геле.

Выход препарата от сорбированного трипсина составляет 88 ., удельная активность — 5200 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ), что в 10 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата; химотрипсиноподобная активность отсутствует в конечном продукте.

Пример 3. Все операции проводят по примеру 2 за исключением того, что для экстракции целевого продукта и его хроматографии используют 0,01 М рН 6,2.

Удельная активность препарата—

5200 ед/мг белка.

Пример 4. Все операции проводят по примеру 2 за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществляют ЗО -ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,2

NaC1.

Выход целевого продукта от сорбируемсго составляет 90% удельная активность (субстрат ТАМЭ) — 5720 ед/мг белка, что в 11 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата, Конечный продукт электрофоретически гомогенен и не содержит химотрипсиноподобной активности.

Пример 5. Все операции проводят по примеру 2, за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществляют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,5Х NaC1.

Выход целевого продукта составляет

84,5, удельная активность 6000 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ).

Использование изопропилового спирта и NaC1 для десорбции трипсина в концентрациях, выше или ниже указанных в формуле, приводит к снижению

его активности на 20-30Х. Применение же одного спирта без NaC1 дает незначительный выход фермента.

Характеристика препарата трипсина представлена в табл. 1 и 2.

Формула изобретения

Способ очистки трипсина путем получения экстракта из пилорических придатков лососевых рыб и его хроматографии на 1,6-диамингексан-носителе, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, экстракцию проводят фосфатным буфером рН 6,0-6,2 с последующей хроматографией на 1,6з 1273392

-диамингексэн-целлюлозе в том же бу- смесью 28-30 изопропилового спирта фере и десорбцией целевого продукта и 1,0-1,5% NaC1, Таблица

Десорбция Изопропиловйй NaC1, М Исходная ак Активность после спирт, . тивность очистки белка

4620

500

0,8

Запред.

5000

510

1,2

Гранич.

4750

500

1,8

Промеж.

4200

486

2,2

Гранич.

3931

500

2,5

Запред.

Таблица 2

Удельная активность, ед/мг белка (TAM3) Способ исходная конечная

5000-6000

500-520

10-12

Предлагаемый

4086

1020

Известный

Заказ 6389/20

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Повышение. удельной активности, pas (степень очистки) Составитель Л, Сабурова

Редактор Л. Повхан ТехредИ.Попович Корректор А. Зимокосов

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Повышение общей активности (выход препарата) 84,5-90

21-27