Способ получения трипептидов
Изобретение касается пептидов, в частности получения трипептидов общей формулы 1 n-Glu-A; -A -NHR, где А ,- Ala, Gly, Val, Leu, Ser, Thr, Phe, He, Pip, Tyr, Pro; АЗ - Arg,. Lye; R - п-нитроанилид, которые проявляют биологическую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности у соединений пептидного ряда были получены новые 1. Их синтез ведут из производного аминокислоты формулы А ,j, - NHR, где А и R имеют указанные значения и соответствующей аминокислоты с последующим наращиванием структуры до требуемого пептида с помощью сочетания остальных аминокислот , причем R используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты . Новые пептиды обладают хромоформными свойствами и более высокой скоростью расщепления при гидролизе субстратов, чем известные, и могут быть использованы в качестве реагентов при определении сериновых и SH протеаз. 4 табл. СО to Г) см
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСГВЬЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К IlATEHTV
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2893256/23-04 (86) РСТ/БŠ— 79/00024(06.02.79)
{22) 06.03.80 (31) 7801373-7 (32) 07.02.78 (33) SE (46) 15.12.86. Бюл. 9 46 (71) Каби АБ (SE) (72) Карл Иеран Клаесон, Лейф Эрик
Аурелл, Лейф Роджер Симонссон .и Сало Ариелли (ЯЕ) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. 1, М.! Мир, 1967, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения трипептидов общей формулы 1 и-Glu-А -А -NHR
2 где А < — Ala, Gly, Val Leu, Ser, Thr, Phe, Ile, Pip, Tyr, Pro; A>—
Arg, Ly8; R — п-нитроанилид, кото, SU „„1277904 А 3 (5ц 4 С 07 К 5/08//С 12 1 38 рые проявляют биологическую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности у соединений пептидного ряда были получены новые 1. Их синтез ведут из производного аминокислоты формулы А — NHR, где А и R имеют укаэанные значения и соответствующей аминокислоты с последующим наращиванием структуры до требуемого пептида с помощью сочетания остальных аминокислот, причем R используют в кач стве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. Новые пептиды обладают хромоформными свойствами и более высокой скоростью расщепления при гидролиэе субстратов, чем известные, и могут быть использованы в качестве реагентов при определении сериковых и SH протеаз. 4 табл.
Изобретение относится к способу получения трипептидов общей формулы
n-Glu-А -А -NH-R (1)
2 где А1 — Ala, Gly, Ual., Leu, Ser, Thr, Pro, Phe, lie, Pip, Tyr;
A — Arg, Lys;
R — п-нитроанилид, новых биологически .активных соеди-. нений, содержащих хромофорную груп- 10 пу, которые могут найти применение в биологии и медицине.
Цель изобретения — Ho&ble производные пептидов, обладающие хромофорными свойствами и более высокой скоростью расщепления.
При анализе элюатов и получаемых продуктов методом тонкослойной хроматографии в качестве адсорбционной среды используют стеклянные пластины 20 с силикагелем F 5 (Мегск) и хромато254 графирование осуществляют в следующих системах:
А: н-бутанол:уксусная кислота:вода 3:2 .1 (по объему);
Р . хлороформ:метанол 9:1 (по объему) .
После хроматографирования пластины просматривают в УФ-свете (254 нм), а затем опрыскивают нингидрином и обрабатывают смесью дикарбоксидин/ ,/хлор, В тексте использованы следующие сокращения; НОАС уксусная кислота;
Вг бензоил; СЬо карбобензокси; ДСС Р 35 дициклогексилкарбодиимид; PCE > треххлористый фосфор; ДМР диметилформамид; Kt N триэтиламин; HOBT 1-оксибензотриазол; ДСНА дициклогексиламин; ДСИ дициклогексилмочевина; 40
EtOH этанол; МеОН метанол; EtOAc этилацетат; OpNP п-нитрофенокси;
pNA п-нитроанилид; ТРА трифторуксусная кислота.
Пример 1. и-Glu-Gly — Arg — 45
pNA ÍÑ1 (м.в.=498,9); (м.с. =530,5),.
175 мл концентрированной уксусной кислоты и 105 мл (5,6 моль) НВг в уксусной кислоте добавляют к 35 r (0,074 моль) CbO-Атд(МО )рНА и смесь перемешивают в течение 30 мин до получения прозрачного раствора. Затем при интенсивном перемешивании полученный раствор выливают в 2 л сухого эфира. Образующийся осадок отфильтровывают и промывают сухим эфиром, высушивают в вакууме над NaOH. Полученную бромистоводородную соль
4 2
Н-Arg (NO,) -pNA растворяют в 150 мл сухого перегнанного диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (— 10 C) с помо11п ю триэтиламина до получения слегка щелочной реакции на увлажненной реакционной смесью рН-индикаторной бумаге. Обычно на нейтрализацию ра<ходуют Et,N в количестве, равном приблизительно 1,5 эквивалента HBr. Образующийся Et>V.
HBr отфильтровывают. При охлаждейии к реакционной смеси добавляют 1,1 эквивалента = 0,8! моль = 76 8 г
СЬо-Gly-OpNP", через 30 мин добавляют еще 1/2 эквивалента = 5,2 моль F.t>N.
Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь. Затем упаривают в вакууме, полученное масло растирают в водном растворе 27 †но NaHCO, затем растворяют в горячем метаноле и кристаллизуют при перемешивании и охлаждении. Образующиеся кристаллы отфильтровывают и промывают холодным метанолом. Хроматография в тонком слое показывает наличие лишь незначительного количества примесей, продукт перекристаллизовывают из того же растворителя. Получают белые кристаллы, представляющие собой согласно результатам тонкослойной хроматографии чистый продукт.
Выход: 34 г (86X) (1 ); Rf=0,20 (P ); Cd 1 -35,4 (С. 0,3 Метанол);
1Ь СЪо-р-(luOH (м.в.=263,3) °
56,3 г (0,20 моль) Cbo — Glu — ОН растворяют в 400 мл этилацетата, добавляют 49,4 r (0,24 моль) дициклогексилкарбодиимида, растворенные в
60 мл этилацетата, и перемешивают при охлаждении на ледяной бане. Через 2 ч образующуюся дпциклогексилмочевину отфильтровывают и оставшийся раствор упариаают досуха. Продукт (ангидрид Cbo Gl:л) кристаллизуют из этилацетата и петролейного эфира.
Ангидрид растворяют в смеси !20 мл диоксана и 260 мл эфира, а затем добавляют 48 мл дициклс"ексиламина (ДСНА), растворенные в эфире до объема 100 .т. Через некоторсе время выпадает в осадок СЬо-р-Glu DACHA. Смесь перемешивают приблизительно в течение часа; а затем образующуюся дициклогексиламмониевую соль отфильтроBb, вают и промывают эфиром и этилацетатом, дициклогексиламмониевую соль суспендируют » эгилацеrare и взбалтывают с ?5 г (0,18 моль) КН80,1, 1277904
Таблица 1
Пример, 9 Rf (система) Е<1 Растворитель Выход, Ж
Вещество
4 5
-54,1 50%-ная НОАС 78
0,29А
0,20Р
0,06Р, 0,29А
flu-Gly-Arg — pNA
-35,4 МеОН
-21,5 DNF
СЬ - — NO.
1Ь
Сьо- — NO
-58,2 50%-.ная НОАС 81 (Glu-Ser-Arg-pNA
Obzl
Boc- — — N0
-24,9 95%-ные Et ОН 84
О, 19Р, IIa растворенным в воде, образующийся в результате этого СЬо-р-GluOH переходит в этилацетатную фазу. Зтилацетатную фазу промывают 10%-ным
NaC1 в воде и сушат над Na l тяжелые кристаллы ХЬ, по данным ТСХ представляющие собой чистый продукт. Выход: 36,9 r (80%) Ib Rf=0,45(A); Ed 3 — 30,3 (С. 1,0 Метанол); 15 IbCbo — p-G1u — Gly-Arg (N0 ) pNA (м.в. 641,6). 10,25 г (18,3 ммаль) Н-Gly-Arg ! NO>(pNA HBr, полученного снятием защитных групп с СЬо-61у-Arg fN02(pNa с помощью HBr согласна методу, описанному в lа, растворяют в 35 мл сухого диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (-10 С) с помощью Et N pe- 25 акции на увлажненной индикаторной бумаге. Образующийся EtNiHBr отфильт.— ровывают. К реакционной смеси добавляют 2,47 r (18,3 ммоль) оксибензотриазола и 5,26 r (20 ммоль) СЬо-р- 30 (! -Glu-OH (ЕЬ ), а затем при низкой температуре добавляют 4,53 r (22 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, растворенных в небольшом количестве диметилформамида. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, затем реакционный раствор упаривают и полученное масло растирают с 2% НаНСО в воде и с чистой водой. Образующееся твердое соединение раст-4р варяют в небольшом количестве ацетона, а затем дабавляют горячий метанол и небольшое количество воды. Продукт кристаллизуется при охлаждении и перемешивании, и образующиеся кристаллы отфильтровывают. Образующийся lb представляет собой согласно результатам хроматографии в тонком слое чистый продукт. После тщательного высушивания в вакууме получают 8,90 г (76%) Ib. R1=0,О6 (R ) 1 fal — 21,5 (С.0,8 диметилформамид) . l,08 r (1,25 ммоль) 1Ь освобождают от защитных групп (деблокируют) с помощью 30 мл фтористоводородной кислоты при О С в течение часа в присутствии 0,6 мл анизола.После упаривания в вакууме продукт растворяют приблизительно в 30 мл 2%-ной уксусной кислоты и промывают небольшим количеством эфира. Водную фазу хроматографируют на колонке с Сафадексом G — 15 (Фармация Файн Кемикалз) в 2%-ной уксусной кислоте с той же средой для элюирования. Фракцию с чистым ацетатом 1 лиофилизируют и пропускают через колонку с ионообменной смолой Q AE-25 (Фармация Файн Кемикалз) в хлоридной форме в смеси этанол:вода (1:1), и той же средой для элюирования. Фракцию с чистым Гидрохлоридом 1 лиофилизируют. ВЫ1сод 485 мл (78%) 1. Хроматография в тонком слое (Rf=0,29 (A)) показывает только одно пятно(с!1 ™ — 54,1 (С. 1,0, 50%-ная уксусная кислота/вода). Пример ы II XIII, описанные в табл. 1, осуществляют способом по примеру 1, физические константы, выходы указаны в табл. 1, условия проведения реакции сочетания и методы очистки указаны в табл. 2. -1277904 (2 3 53 — 18, 5 DNF OBzl Вос- — — NO IIIa 0,18Р СЬо ОВк1 NO -26, 2 NF IIIb О 16Р1 IV 0,33A (G1u-Val-Arg-pNA +5,4 О, 38Р„ 0,08Р, 0,25А DMF IVa СЪо- NO -21,5 DMF IVb СЬо (Glu-Аlа-Arg-pNA 0,25P„ +2,4 DNF СЬо- — NO СЪо- — NO ЕС1и-Pro-Arg-pNA 48 -30,9 DNF -95,6 МеОН вЂ” 33,0 DMF -66,3 DMF 73 82 Cbo- — 110 СЬО- — Чо VIa VIb VII flu-Phe — Arg-pNA +5,5 VIIa СЬо- — NO СЪо- — NO D Glu-Gly-Arg-pNA -7,4 VIIb VIII VIIIa 0,20P. -35,4 МеОН СЬо- — NÎ Cbo- NO -5,7 VIIIb Т.Х D4G1u-Pro-Arg-pNA Cbo- — — NO Cbo-D- — NO 2 (G1u-Phe-Lys-pNA -33,0 DMF -37 7 DMF IXa IXb Е-СЬо Вос77 +3, 4 DMF 0,55Р, E-Cbo сь -— -8, 8 DMF 0,40Р, 0,31А XI СЬо- НΠ— — IIb 0,15Р, Obz1.«Glu-Thr-Arg-pNA III 0,32А 0,05Р, 0,38А 0,45P„ 0,69А 0,36А О, 29Р, О,OÇP, 0,27А О, 06Р 0,35А 0,45Р, О., 1ОР O,ЗЗА 4 ) 5 6 -55, 7 50%-ная НОАС 72 — 25,4 95% — ный Et ОН 85 -66,5 50%-ная НОАС 56 -0,68 50%-ная НОАС 58 -22,8 50%-ная НОАС 66 -41,8 50%-ная НОАС 53 -99,0 50%-ная НОАС 56 -28,7 50%-ная НОАС 69 -61,7 50%-как НОАС 85! 277904 Продолжение табл. 1 Е-СЬо ВосXIa -4,5 DMF O,49Р: О, 48Р,. 0,32А 0,22А 0,3ОА Е-СЪо Cbo-— XIb -27,2 DMF XIIa 100 Glu-Ile Lys-pNA -69, 7 50%-ная НОАС 78 XIII -СЬо Вос Glu-СЬо XIIIa 0,52Р XIIIb 0,48Р XIV 0,36A -Э,О DMF СЬ СЬо -25,4 DMF Glu-Pip Arg-pNA NO% -26,2 DMF XIVa 0,50Р XIVb 0,10Р XV 0,40A NO -45,0 DMF Glu-Tyr-Arg-pNA Bzl NO СЬо XVa 0,48Р„ +12,8 DMF NOя -4, 1 DMF XVb 0,08 Продолжение табл.2 Таблица 2 Пример, 9 Условия проведения процесса IIIa HOBT, DCCl, крист. EtOAc IIIb HOBT DCCI крист. EtOAc HF, анизол, G-)5 2Х-ная НОАС 45 OpNP, крист. МеОН НОВТ, DCCI, крист. МеОН IVa IUb HF, анизол, G-15 2Х-ная НОАС НОВТ, DCC), крист. эфир )lа HOIST, DCCI, крист. Et OH+ )5 +H 20 I IЬ HF, анизол, G-15, 2Х-ная НОАС ЧЬ СЬо-pyro-Glu-Gly-ArgP щ ХТТ -45,7 50Х-ная НОАС 52 -107 50Х-ная НОАС 59 -30,2 50%-ная НОАС 60 +петрол. эфир HF, анизол, G-15, 2%-ная НОАС OpNP, крист. DMF, МеОН+ +эфир НОВТ, DCC1, крист. EtOH+ +Н О HF, анизол, С-15, 2%-ная НОАС OpNP, крист. МГ, МеОН+ +эфир НОВТ, DCCI, крист. ацетон+МеОН 1277904 Продолжение табл. 2 HF, анизол, QAE-25 957-ный МеОН ХЬ VIa OpNP, крист. EtOAc+ +эфир 1О XI VIb XIa VII X1b VI Ea XIII VIIb XIIIa XIIIb VIII 0pNP, крист. МеОН VIIIa VI IIb HF, анизол, QAE-25, 95%-ный МеОН XIV XIVa XIV в IXa HF, анизол, QAE 25 50% †í EtOH IXb OpNP MeOH+H О г OpNP KtOH+H О XVa XVb Продолжение табл. 2 НОВТ, DCC1, крист, DMF+ +ЕtOAc HF, анизол, Г-15, 2%-ная НОАС OpNP, крист. MeOH+H О НОВТ, DCC1, крист. ацетон+МеОН+Н О 20 HF, анизол, G-15, 2%-ная НОАС НОВТ DCCI, крист. МеОН+ +Н О HF, анизол, G-15, 27.-ная З0 НОАС OpNP, крист. Е ОАс+эфир НОВТ, DCC1, крист. MeOH+ +Н О HBr/НОАС, QAE 25 507.-ный EtOH Проведены испытания трипептидов общей формулы (I), полученных предлагаемым способом и определение протеаэ с помощью субстратов с группа- 45 ми, подверженными отщеплению и. or!ределению физико-химическими методами. Субстраты, пол "ченные,согласно приведенным примерам, могут быть использованы для определения различных 50 энзимов следующим образом. В основе определения лежит roч факт, что продукт расщепления, об— разующийся в результате энзиматического гидролиза, имеет УФ-спек р, по существу отличный от УФ-спектра сy."-страта. Таким образом, все и-нитроанилидные субстраты по изобретению, например, характеризуются максимумом OpNP, крист. MeOH+H О НОВТ, DCCl, крист. MeOH+ +Н О HBr/HOAc, QAE-25 50%-ный EtOH OpNP, крист. MeOH+H 0 HOBT, DCCl, крист. ацетон+МеОН Hbr /НОАС, QAE-25, 50%-ный Kt0H OpNP, 1eOH+H О НОВТ, DCC1, ацетон+МеОН 0pNP, этилацетат+эфир НОВТ, DCC1 0МУ+этилацетат поглощения при 310 нм с молярным коэффициентом экстинкции примерно 12000. При 405 нм поглощение этих субстратов почти полностью исчезает п-Нитроанилид, который высвобождается из субстратов при энзиматическом гидролизе, имеет максимум поглощения при 380 нм и молярный коэффициент "-.êñòèHêöèè 13200, который при 405 нм снижается талька до 9б20. Поэтому с помощью снятия спектрофотометрических данных при 406 нм легко следить за количеством образующегося п-нитроанилида, которое пропорционально скорости энзиматического гидролиза, которая, в свою очередь, определяется количеством активного энзима. 11 127730« 12 В табл. 3 представлены значения каждого энзима скорость реакции вэяскоРостей реакций синтетических суб- та относительно субстрата сравнения стратов с различными энэимами. Для (скорость реакции = 1). Таблица 3 Субстрат сравнения (=100X) Энэимы ТА Pl i Fxa Try S-2222 S-2251 S-2160 100 100 lO 330 100 360 140 370 1 n-Glu Gly Arg pNA II n-Glu Ser Arg pNA 130 150 V и-С1и Ala Arg pNA 170 250 3lO VI n-Glu Pro Arg pNA VII n Glu Phe Arg pNA Х и Glu Phe Lys pNA XI n Glu Leu Lys pNA 440 240 10 450 10 230 120 XII pyro Glu-Gly Arg pNA 15 340 260 П р и м е ч а н и е : S-2251 Н-DVal Leu-Lys pNA; S-2160 Bz Phe-Ча1-Arg-pNA; S-2222 В Ile-Glu-Gly-Arg pNA; р1i плазмин, Try трипсин, Fxa — фактор коагуляции, UK — урокиназа, ТА плазминогенный тканевый активатор.. Чувствительность субстрата срав- вестные, и могут быть использованы нения к исследуемому"энзиму приведе-, в качестве реагентов при определе35 на в табл. 4. нии сериновых и SH протеаз. Таблица 4 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Субстрат. Энзим Активность (аО д/мин) достигаемая с 4 10 моль/л энзима Способ получения трипептидов общей формулы 1 n lu-А -А -NH-R 1 где А — Ala, Gly, Val, Leu, Ser, Thr, Pro, Phe, Ile, Pip, Туг; А — Arg, Lys; R — - п-нитроанилид, отличающийся тем, что производное аминокислоты формулы ll А 11НК где А и R имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу R используют в качестве защитной для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. S-2251 S-2160 S-2222 0,040 0,150 0,200 0,040 Плазмин Трипсин Fxa Урокиназа I Тканевый активатор 1 0,040 Как видно из приведенных таблиц, предлагаемые субстраты гидролизуются различными энэимами быстрее, чем из1