Способ определения активности протеиназ

 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к способам измерения активности протеиназ. Цель изобретения - упрощение процесса определения активности протеиназ и повышение точности анализа. В качестве искусственного субстрата протеиназ вместо 1-(аминоацш1)аминонафталина используют 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислоты. После воздействия протеиназ на этот субстрат образуется 1-аминонафталин-5-сульфокислота, которую вводят в реакцию азосочетания с диазосоединением. Образующийся при этом окрашенный продукт растворим в воде, что позволяет определять,его количество спектрофотометрически в водных растворах. В качестве субстратов используют трипсин, какелен, тромбин. В этом случае время инкубации 3U мин, температура 2/°С, 1 з.п. ф-лы. Q iS (Я

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„, 1278361

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 383546?/28-13 (22) 29. 12. 84 (46) 23. 12.86. Бюл. Ф 47 (71) Институт молекулярной генетики

AH СССР (72) А.А.Недоспасов, В.Н.Незавибатько и Н.В.Кузнецов (53) 577. 15 (088.8) (56) Methods in Enzymology, — N-У, 1976, 44, р.198, 266-267, 530.

Green M.N., Kwan-Chung Tson, Bressler R., Seligman А.M. Arch. Вiochem;

Biophys 1957» р. 458-474. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕПЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ПРОТЕИНАЗ (57) Изобретение относится к области биохимии, конкретно к способам измерения активности протеиназ. Цель дд4 С 12 Я 1/00 С 12 N 9/76 изобретения — упрощение процесса определения активности протеиназ и повышение точности анализа. В качестве искусственного субстрата протеиназ вместо 1-(аминоацил)аминонафталина используют 1-(аминоацил)аминонафта-. лин-5-сульфокислоты. После воздействия протеиназ на этот субстрат образуется 1-аминонафталин-5-сульфокислота, которую вводят в реакцию азосочетания с диазосоединением. Образующийся нри этом окрашенный продукт растворим в воде, что позволяет определять,его количество спектрофотометрически в водных растворах.

В качестве субстратов используют трипсин, какелен, тромбин. В этом случае время инкубации 30 мин, температура 3/ С. 1 з.п. ф-лы.

1278361

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам измерения активности протеиназ.

Цель изобретения — упрощение про" цесса определения активности протеиназ. и повышение точности анализа.

Сущность способа заключается в том, что в качестве искусственного субстрата протеиназ вместо 1 — (аминоацил) аминонафталина используют

1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислоты. После воздействия протеиназ на этот субстрат образуется 1-амино нафталин-5-сульфокислота, которую вводят в реакцию азосочетания с диазосоединением. Образу!ощийся при этом окрашенный продукт растворим

13 воде, чTG позволяет Определять el o количество спектрофотометрическп в водных растворах.

Применение способа позволяет достичь сокращения време!Еи анализ» (за счет меньшего времени инкубацип, и исклю«1ее!Ия операций зкстракции и цен трифугирОЕЗ сз ния) ув ели 1е ния тОч ности !!наел!за, так как исключаются опер ацеп1 переноса IloùL«o TI«à (проба— экстракт; экстракт — центр!!фуга., центрифуга — кювета спектрофотометра), во время которых часть егo неизб ежно теряется, упроще нпе! анализа (за счет меньшего чис11а операций).

Кроме того использованпе и качестве диазосоедпнения 4 †ннтрофенил-. диазоен1п позволяет получать линейную з;1езпсимОсть между ноглощееlпем красителя и количеством получившегося D хо !(е ферме Il. I ë ти131! Ои pc акции

4 — а!епно11афталl — 5 с Jllе)фокислсты „

Пример 1. Определение акти1зности трипсина с использованием 1(N -карбобензоксиаргпнил)аминопафт ллие1-5- суп 1«фо ки сз! О тьl .

Готоззят следующие рабочие ре!< творы:

I) О, 1 li трнс — IIC1 буфер, .рН 11, 0;

2) 10 М 1-(карбобензоксиаргппил) амз!Ионафталпн-5-сульфокислоты в растворе 1;

3) I мМ борфторида нитрофениндиазонпя в 0,9 М уксусной кислоте.

К 1 мл териостатированного при

25 С раствора 2 добавляют 50 мкл раствора исследуемого препарата фермента в растворе 1, перемешиваю.: встряхиванием, инкубируют 20 мин, добавляют 1 мл раствора 3 и через

5 мин определяют оптическую плот-ность при 520 нм, используя в -качестве раствора сравнения инкубировавшуюся, как указано выше, смесь 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3, в которую фермент добавлен после приготовления смеси. Активность фермента определяют по калибровочной кривой зависимости оцтической плотности при

520 нм (максимум поглощения продукта) от содержания фермента, построенной по измерениям, выполненным в ана- .логичных условиях по стандартному

1образцу фермента.

Пример 2. Определение проводят, как описано в примере 1, используя в качестве субстрата трипсина

1-(тозилглицил-1-пропил-1-аргинил)

20 аминонафталин-5-сульфокислоту. Бремя инкубации 10 мин.

Пример 3. Определение прово,цят с тем же субстратом, что и в примере 2, используя в качестве фермента тромбин. Время ипкубации 2 мин, температура 37 С.

Пример 4. Проводят .определение активности папаина, растворенного в 0 05 М трис-НС1 буфере, рН д рж щ м 1 мМ эт тетраацетата и 1 мМ дитиотрептола, используя в качестве субстрата (М -карбобензоксиаргипил)аминонафталпн-5 — сульфокислоту. Время инкубации 10 мин, температура 25 С.

Пример 5. Проводят определе. ние активности проназы, растворенной в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,8, используя в качестве субстрата (лейцпн)аминонафталин — 5-сульфокислоту.

Время инкубации 10 мин, температура

25 С, Пример 6. Проводят определеЕпне активности „ как описано в примере 1, но в качестве фермента исполь- 4 зуют тромбин. Время инкубации 30 мин, О температура 37 С. Результаты измереIIIIII активности указанных ферментов нредлагаемым способом соответствуют данным, полученным известными способами, Таким образом, использование изобретения позволяет упростить способ

Опрецеления активности протеиназ и увеличить его точность за счет исключения стадий, вносящих ошибку в анализ. Кроме того, при осуществлении способа не применяются органические растворители.

1278361

Формула изобретения

R -NH (oOo)

S()3

Составитель В.Муронец

Редактор В. Петраш Техред А. Кравчук Корректор А.Тяско

Заказ 6808/23 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Способ определения активности протеиназ, заключающийся в расщеплении протеиназами субстратов-производ- 5 ных 1-(аминоацил)аминонафталина, обработке полученного продукта гидролиза диазосоединениями и измерении поглощения образующегося в реакции азосочетания продукта, о т л и ч а ю-1О шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения точности анализа, в качестве субстратов-производных 1-(аминоацил)-аминонафталина используют 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислоты общей формулы где R — аминоацил, ациламиноацил или пентидил.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве диазо-: соединения используют соль 4-нитрофенилдиазония.