Способ получения олигосахаридной фракции

 

Изобретение касается производных гепарина, в частности олигосахаридной фракции (I), включающей 4-8 моносахаридных звеньев, где указанный олигосахарид содержит по крайней мере одно 3-0-сульфатированное звено глюкозамина, которое также является 2-0-сульфатированным и 2-Н-сульфатированным, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированного звена глюкозамина, которая как обладающая избирательным противокоагулирующим действием может быть использована в медицине . Для выявления более избирательной противокоагулирующей активности получена ОЛИгосахаридная фракция 1. Последнюю получают деполимеризацией гепарина обработкой азотистой кислотой в диметоксиэтане при (-10) С с последующим высаживанием зтанолом осадка производных гепарина, после чего его растворяют в 0,05 М растворе хрорида натрия (0,05 М НСВ) при рН 7,4 и полученный раствор разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке, содержащей антитромбинсефарозу. Установлено, что фракция .I имеет преимущества в противокоагулирующем действии в сравнении с гепарином. О) С N9

СОЮЗ COBETCHHX

РЕСПУБЛИК

„,SU„„1289

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТ,Ф

4ASI ь з Ы

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

f10 fLERAM ИЗОБРЕТЕНИЙ H ОТКРЫТИЙ (21) 3440803/23-04 (86) РСТ/SE 81/0052. (10.09.81) (22) 14.05.82 (31) 8006459-5 (32) 15.09.80 (33) SE (46) 07.02.87. Бюл. У 5 (71) Каби AS (SE) (72) Ульф Пер Фредрик Линдаль, Гудрун Элизабет Бекстрем и Джон

Янгве Леннарт Тунберг (SE) (53) 547.917.07(088.8) (56) Европейский патент У 0014184, кл, С 08 В 37/10, опублик. 07.01.80.

Патент Великобритании 11 2002406, кл. С 08 В 37/10, опублик. 1979.

Патент Великобритании 8 2035349, кл. С 08 В 37/10, опублик. 18.06.80. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОСАХАРИДНОЙ ФРАКПИИ (57) Изобретение касается производных гепарина, в частности олигосахаридной фракции (1), включающей 4-8 моносахаридных звеньев, где указанный олигосахарид содержит по крайней мере одно 3"0-сульфатированное эве(51)4 С 07 Н 3/06, С 08 В 37/10 //

// А 61 К 31/72 ф но глюкозамина, которое также является 2-О-сульфатированным и 2"N-сульфатированным, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-О-сульфатированного звена глюкоз амина, которая как обладающая избирательным противокоагулирующим действием может быть использована в медицине . Для выявления более избирательной противокоагулирующей активности получена олигосахаридная фракция 1, Последнюю получают деполимернзацией гепарина обработкой азотистой кислотой в дно метоксиэтане при (-10) С с последующим высаживанием этанолом осадка производных гепарина, после чего его растворяют в 0,05 М растворе хр орида натрия (О, 05 М НС У) при рН 7,4 и полученный раствор разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке, содержащей антнтромбинсефарозу, Установлено, что фракция .I имеет преимущества в противокоагулирующем действии в сравнении с гепарином.

1 12

Изобретение относится к способу получения новых производных гепарина, именно олигосахаридной фракции,. включающей в себя 4-8 моносахаридных звеньев, где указанный олигосахарид содержит по крайней мере одно 3-0сульфатированное звено глюкозамина, которое также является 2-0"сульфатированным и 2-N ñóëüôàòèðîâàííûì, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированного звена глюкозамина, обладающим избирательным противокоагулирующим дей" ствием, Цель изобретения — получение новой олигосахаридной фракции, обладающей улучшенным противокоагулирующим действием .в сравнении с гепарином.

Пример 1, Приготовление фрагментов гепарина посредством деполимериэации азотистой кислотой обычного гепарина.

Гепарин (0,5 г), изолированный иэ свиных кишок и растворенный в 150 мл о воды, охлаждают до 4 С и пропускают чере. колонку, заполненную синтетической ионообменной смолой "Доуэкс® 50 И-28" (Н форма), 200400 меш. Затем колонку промывают

100 мл воды и промывную жидкость объединяют с пробой, К пробе добавляют 250 мл диметоксиэтана (glyme), охлажденного до минус 20 С, и 10 мл иэоамилнитрита, после чего смесь, о имеющую минус 10 С оставляют стоять

35 мин. Затем реакцию прекращают добавлением Na ацетата, После добавления 5,2 л этанола выпавший в осадок углевод (производные гепарина) выделяют центрифугированием. Про дукт растворяют в 500 мл 0,05 M растворе HCE рН 7,4. Этот раствор разделяют на порции по 100 мл и фракционируют посредством аффинной хроматографии на колонке, содержащей 75 мл антитромбинсефароэы (около 5 мг протеина на 1 мп геля). Находящийся в колонке адсорбент отмывают солевым градиентом (500 мп

3 М NaCX - 0,05 М трис-HCE в резервуаре), причем основная часть материала или проходит неудержанной через колонку или отмывается из адсорбента при низком значении ионной силы (меньшей, чем 0,4 М НаСУ), 89392 2

20 г

3Q

55 этот материал не обладает биологической активностью, Активные компоненты (материал в виде очищенного олигосахарида отмывают в виде широкой головной фракции 0,5 М NBCI u

3 М NaC1, соответствующие примерно

37 исходного материала. Эти фракции объединяют, концентрируют и обессоливают посредством хроматографии на геле.

Олигосахариды, приготовленные и очищенные по указанному способу, имеют преобладающий молекулярный вес приблизительно 1200-2400 дальтон, соответствующий таковому у октасахарида, соответствующего изобретению.

Исследование противокоагуляционной активности, Олигосахариды, приготовленные по примеру 1, исследуют, имея в виду их способность: воздействовать на ингибирование энзима коагуляциитромбина; воздействовать на ингибирование фактора активирования коагуляции Х; воздействовать на ингибирование активированного фактора 1Х; воздействовать на ингибирование активированного фактора Х; воздействовать на ингибирование активированного фактора XI; воздействовать на ингибирование активированного фактора XII; пролонгировать длительность коагуляции в ходе проверочного испытания на коагуляцию кровяной плазмы по методу АРТТ (продолжительность активированного частичного образования кровяных сгустков); быть нейтрализованными компонентами кровяной плазмы и влиять на агрегирование тромбоцитов.

Пример 2, Ингибирование тромбина, Анализируют способность олигосахаридов усиливать ингибирование тромбина посредством антитромбина III согласно измененному способу Teien c сотрудниками, Найдено, что олигосахариды имеют специфическую активность 8 Е/мг в сравнении с 120170 Е/мг для "стандартного" гепарина.

Пример 3. Ингибирование фактора активирования Х.

Способность олигосахаридов усиливать ингибирование фактора активирования Х в плазме и в чистом антитромбине III исследуют согласно ви289392 4

Нейтрализующее действие компонентов плазмы по отношению к олигосаf0

50 антитромбинсефарозу, 1

ВНИИПИ Заказ 7827/60

Произв.-полигр. пр-тые, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1 доизмененному варианту способа Teien с сотрудниками, Показано, что олигосахариды обладают специфической активностью 500 Е/мг в системе чистого антитромбина III и 1900 Е/мг в системе плазмы в сравнении с 120170 Е/мг для "стандартного гепарина", Пример 4. Ингибирование фактора активирования IX

Способность олигосахаридов усиливать ингибирование фактора активирования IX в чистом антитромбине III исследуют по .НоЬпег с сотрудниками. Показано, что олигосахариды имеют специфическую активность

l8 Е/мг в сравнении с 120-180 Е/мг для "стандартного" гепарина, Пример 5, Ингибирование фактора активирования IX.

Способность олигосахаридов уси- . ливать ингибирование фактора активирования IX в чистом антитромбине III исследуют по HoImer с сотрудниками, Показано, что олигосахариды обладают специфической активностью 40 Е/мг в сравнении с 120170 Е/мг для "стандартного" гепарина.

Пример 6. Ингибирование фактора активирования XII

Способность олигосахаридов усиливать ингибирование фактора активирования XII в чистом антитромбине

III исследуют согласно Holmer с сотрудниками, Найдено, что олигосахариды обладают специфической активностью 470 Е/мг в сравнении со "стандартным гепарином.

Пример 7, Пролонгирование продолжительности коагуляции, Способность олигосахаридов увеличивать продолжительность времени, требующегося для коагуляцйи у кровяной плазмы, изучают согласно способу АРТТ (время, необходимое для образования кровяных сгустков у частично активированного тромбопластина). Олигосахариды показывают специфическую активность 12 Е/мг в сравнении с гепарином по 3 международному стандарту. Стандартный" гепарин показывает специфическую активность в пределах 120-170 Е/мг.

Пример 8. Нейтрализация олигосахаридов в плазм крови, харидам получают посредством измерения действия гепарина и олигосахаридов в плазме и в системе чистого антитромбина. Указанное действие осуществляют путем измерения количества активирующего фактора Х, ингибированного в двух системах при наличии некоторого определенного количества гепарина или олигосахарида, Показано, что активность олигосахаридов характеризуется 18Х-ной нейтрализацией компонентов плазмы. Было показано 1 что соответствующая величина для "стандартного" гепарина составляет 757, Пример 9, Влияние на тромбоциты, Способность олигосахаридов агрегировать тромбоциты при критических концентрациях AQP (аденозин дифосфата) изучают в основном по Beck Е, А.

Показано, что способность олигосахаридов к агрегированию тромбоцитов оказалась в 10 раз меньшей, чем у

"стандартного" гепарина в весовом исчислении.

Формула изобретения

Способ получения олигосахаридной фракции, включающей в себя 4-8 моно» сахаридных э вен ье в, где указ ан ный олигосахарид содержит по крайней ме- ре одно 3-0-сульфатированное звено глюкозамина, которое также является

2-0-сульфатированным и 2-Н-сульфа- . тированным, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированного звена глюкоэамина, о т— л и ч а ю шийся тем, что гепарин деполимеризуют обработкой азотистой кислотой в диметоксизтане при температуре (-10) С с последующим высаживанием этанолом осадка производных гепарина, после чего его растворяют в 0,05 M растворе хлорида натрия (0,05M НС f) при рН 7,4 и полученный раствор подвергают разделению с помощью аффинной

55 хроматографии на колонке, содержащей

Тирах 369 Подписное