Штамм вольвоксовой водоросли dunaliella salina teod calu- 834-продуцент белково-каротиновой биомассы

 

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов - продуцентов белково-каротиновой биомассы. Цель изобретения - получение штамма водоросли с высоким содержанием ft - каротина и белка. Полученньй штамм может быть использован в микробиологической промьпиленности для получения белка и /3 -каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов. Сухая биомасса клеток штамма содержит 38-43% белка, 31-36% глицерина, 6-9% /j-каротина, 5-9% зольных веществ. Штамм успешно размножается в сточных водах птицефабрик . 1 табл. (Л 00 ю 4 О5 to

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 А 23 К 1/00, А 01 Н 13/00, l

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ/3, \!

/ Р/

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3980178/31 — 13 (22) 19. 11. 86 (46) 23.07.87. Бюл. № 27 (7I) Кишиневский государственный университет им. В.И. Ленина (72) В.Ф. Рудик, П.А. Обух и В.М. Щй-. ларь (53) 636.085.639.64(088.8) (56) Патент CIIIA № 4511, кл, А 01 Н 13/00, 1980.

Патент CIIIA ¹ 4199895, кл. 47-1.4, 1980. (54) ШТАММ ВОЛЬВОКСОВОИ ВОДОРОСЛИ

DUNALIELLA. SALINA TE0D CALU- 834

ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВО-КАРОТИНОВОИ БИОМАССЫ (57) Изобретение относится к штаммам микроорганизмов — продуцентов белково-каротиновой биомассы. Цель изобретения — получение штамма водоросли с высоким содержанием  — каротина и белка. Полученный штамм может быть использован в микробиологической промьпаленности для получения белка и

-каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов. Сухая биомасса клеток штамма содержит 38-43Х белка, 31-367 глицерина, 6-9Х р-каротина, 5-97 зольных веществ. Штамм успешно размножается в сточных водах птицефабрик. 1 табл.

1 132462

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов-нродуцентов белковокаротиновой биомассы и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения белка и и -каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных и рыб, а также для утилизации отходов агропромышленного производства. !О

Целью изобретения является получение штамма одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella заLina Teod, характеризующегося более высоким синтезом р-каротина и белка в биомассе. 15

Штамм выделяют из водорослей, собранных в прибрежной зоне лимана Сасык. Очищают штамм от сопутствующих водорослей путем многократного пересева на жидкой и агаризованной средах Масюк, г/л: NaC1 116; NgS0< Н О

5; КИО 2, 5; К НРО 0,2; вода — остальное.

Морфолого-культуральные признаки штамма. При выращивании на жидкой сре.-25 де клетки одиночные, активно двигаются, овально-грушевидной формы, размерами 4,4х11,0-6,7х18,7 мкм. Хлоропласт чашевидный, занимает почти всю периферическую базальную часть клет- 30 ки, пиреноид один, крупный, окруженный крахмальными зернами, стигма и основания жгутиков в передней части клетки хорошо различимы в оптическом микроскопе. Жгутики в 1,5-2 раза длин-35 нее клетки, изогнутые к ее базальной части.

При истощении питательной среды, неблагоприятной температуре и освещении клетки прекращают движение, при- щ обретают округлые очертания диаметром 13-20 мкм, покрываются тонким слоем слизи. Отдельные клетки продолжают делиться и образуют пальмеллевидные скопления, другие превращаются в цисты с утолщенными оболочками, зернистым содержимым оранжевокрасного цвета.

На агаризованной среде клетки более или менее округлых очертаний

9-16 мкм в диаметре, с крупным зеленым хлоропластом и стигмой, одним пиреноидом, окружены слоем слизи.

Клетки после деления иногда остаются рядом, образуя скопления. 55

На жидких средах суспензия водоросли зеленого цвета, при сильном освещении с желто-оранжевым оттенком.

Клетки не прирастают к стенкам со7 2 суда, суспензия при отсутствии перемешивания концентрируется в нижней части сосуда, образуя осадок, который легко ресуспендируется при встряхивании или перемешивании.

На агаризованной среде образует колонии зеленого цвета, диаметром

1-2 мм, окруженные иногда каемкой, состоящей из бактерий. При культивировании на жицких питательных средах в стационарных условиях штамм образует нежную пленку маслянистой консистенции, которая легко разрушается при перемешивании.

Штамм размножается путем продольного деления клеток в подвижном или неподвижном состоянии, преимущественно в ночное время. В пальмеллях клетки также размножаются делением.

При интенсивном культивировании клетки делятся вне прямой связи с режимом освещения.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо развивается на минеральной среде следующего состава, г/л:

NaC1 120,0; NaHC03 Z,О; MgSO<. 7H>О

О, / 5; NaN0> 0,5; КС1 0,15; КНгРО+

0,05; Fe-EDTA 0,05 мл, 0,05 мМ раствора, вода воцопроводная — до 1 л, рН 8,5-8,8, а также на средах, содержащих сточные воды животноводческих комплексов (содержание органического вещества по ХПК не более 1000 мг О / л), при добавлении 6-122 хлорида натрия и О,ZZ бикарбоната натрия при 2729 С, непрерывном освещении о (20 тыс. эрг/см - с) и перемешивании.

Штамм характеризуется высокой продуктивностью в условиях интенсивного культивирования. На минеральной среде биомасса дуналиеллы на шестой день культивирования достигает

1,8 г/л сухого вещества, а на средах, прнготовленньгл на основе сточных вод животноводческих комплексов, — 1,6 г/л.

На свежей питательной среде клетки D.salina Teod. CALU- 834 двигаются достаточно активно в разных направлениях. По мере утилизации основных компонентов питательной среды (в первую очередь, азота и фосфора) в накопительной культуре примерно на 1012 сут большая часть клеток прекращает движение„ но сохраняет жизнеспособность, переходя в пальмеллевидное состояние или в стадию цисты.

Некоторая часть клеток подвергается липпису. Повышение температуры выше (37 С) ведет к тем же последствиям, о

1324627 но возрастает процент отмирающих клеток.

При слабом освещении (менее

3 тыс. эрг/см . с),клетки культур в возрасте 6-10 сут имеют ярко-зеле5 ную окраску и активную подвижность.

При освещении менее 200 эрг/см с движение клеток замедляется или пол ностью прекращается, но клетки сохраняют стигму и жгутики. При воз- 10 обновлении экспонирования при сильном освещении клетки быстро (за 510 мин) восстанавливают активное движение.

Штамм способен развиваться при 15 очень сильном освещении (30100 тыс.эрг/см с), при этом возрастает биопродуктивность, клетки становятся ярко-оранжевыми вследствие биосинтеза преимущественно р каро- 20 тина, Степень чистоты штамма. Штамм

D. salina Teod. CALU-834 выделен в альгологически чистой культуре.

При массовом выращивании не за- 25 грязняется другими видами водорослей в связи с высокой селективностью питательной среды.

Влияние рН и температуры среды на рост культуры показано в таблице. 30

Клетки сохраняют жизнеспособность при отрицательных температурах (-3)(-5) С на среде с 12Х хлористого натрия. 35

Отношение штамма к углероду и азоту. Штамм D. salina Teod. CALU-834 способен использовать в качестве источника углерода бикарбонат, а такж углекислый газ, углеводы (в основном щ моносахара), глицерин и др.

В качестве источника азота лучшим является нитрат, но водоросль способна использовать и аммонийный азот в концентрациях не более 25-50 мг/л.. 45

Штамм культивируют на сточной воде животноводческого комплекса (СВЖК}.

Перед использованием для культивирования D. salina Teod. CALU-834 СВЖК отстаивают в течение 12-24 ч, затем 50 разбавляют до ХПК (химическое потребление кислорода} 750-1000 мг/о О .

После этого питательная среда имеет рН 7,8-8,3 и следующий состав, мг/л: . 55 .Суммарный азот 90-140

Суммарный фосфор 70-90

Кальций 80-90

Калий 120-130

Магний 100-150

Бикарбонат 300-500

Сульфат 400-500

К указанной среде добавляют 12Х хлорида натрия и 0,157. бикарбоната натрия, перемешивают до полного растворения солей, после чего готовую среду разливают по соответствуюпим емкостям, производят инокуляцию суспензий штамма D. salina Teod.CALU †8.

Сухая биомасса дуналиеллы имеет состав, 7: белок 38,43; глицерин 3136; /1 -каротин 6-9; зольные вещества 5-9.Используется штамм D.salina

Teod. CALU-834 следующим образом.

Пример 1. В сосуды объемом

2 л с жидкой минеральной средой следующего состава, г/л: NaC1 120,0;

NaHC03 1,0; MgSO 7Н О 0,75; NaN03

0,5; КС1 О, 15; КН>РО< 0,05; Fe-EDTA

0,05 мл 0,5 мМ раствора, рН 8,5-8,8, приготовленной на водопроводной воде, вносят инокулят дуналиеллы из расчета 0,3 г/л сухой массы.

Культивирование осуществляют при постоянном перемешивании, освещении

15 тыс эрг./см с, температуре 2729 С и ежедневном добавлении по

0,2 г/л бикарбоната натрия.

Содержание каротина определяют по

ГОСТУ. Для экстракции р -каротина вместо петролейного эфира (гексана, бензина) используют хлороформ, а его количество в элюате определяют на спектрофотометре при длине волны

464 нм.

Продуктивность дуналиеллы на шестые сутки составляет 1,8 г/л сухой массы, содержащей, 7: белок 38, глицерин 36, -каротин 8,2.

Пример 2. Суспензию дунали-. еллы вносят в питательную среду, содержащую сточные воды животноводческих комплексов (ХПК 750 мг/л О>, 12Х хлорида йатрия и 0,17. бикарбойата натрия), из расчета 0,3 г/л сухого вещества. Водоросль культивируют при постоянном перемешивании и освещении

15 тыс. эрг/см . с, температура 2729 С и ежедневном добавлении 0,2 г/л бикарбоната натрия.

Продуктивность на шестые сутки составляет 1,6 г/л сухой массы дуналиеллы, содержащей, 7: белок 43, глицерин 31 и р каротин 5,6.

Пример 3. Предлагаемый штамм культивируют в условиях примера 1.

Через 6 сут биомасса достигает 1,8 г/л сухой массы. Часть суспензии (257) 132462

Условия

Параметры среды

Минимальные Оптимальные Максимальные

6,3-7,0

8,5-9,0

10,5-10,8 рН

Температура, С

37-38

28-32

1-2

Тираж 530

ВНИИПИ Заказ 2986/2

Подпис ное

Производств.-полиграф. пред-е, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ежесуточно изымают и вместо нее вносят эквивалентную порцию свежей питательной среды. На следующие сутки биомасса водоросли достигает исходных величин ° Такая полунепрерывная культу-5 ра дуналиеллы поддерживается в течение месяца.

В сопоставлении с известным штаммом Pedinomonas tenuis Massjuk N 153, биомасса которого на 6-е сутки дости- !0 гает 1,5 г/л и содержит 29,87. белка и 0,008-0,0127. (80-120 мкг/r) каротинов, использование предлагаемого штамма D.Salina Teod. CALU-834 позволяет получить на шестые сутки 1,6- 15

1,8 г/л сухой массы, характеризующейся высоким содержанием белка (38437) и особенно А -каротина (5,6 .8,27), что значительно больше, чем в биомассе известного штамма, исполь- 20 зуя для этой цели как минеральную среду, так и среды, приготовленные на основе сточных вод животноводческих комплексов.

Преимущества предлагаемого штамма D.Salina Teod. CALU-834 по сравнению со штаммом D.hardavil заключаются в следующем.

Штамм D.Salina Teod. CALU †8 отличается более высокой продуктив- ЗО ностью, чем D.bardawil ATCC 3.0861.

При культивировании известного штам| ма в полунепрерывном режиме штамм D.bardawi1 достигает максимальной биопродукции 30 г/м сут абсолютно 35 сухого вещества (АСВ), в т.ч. глицерина 10 г/м . сут и каротина 0,7 г/м

2 сут. Штамм D.Salina CALU-834 согласно примеру 3 описания в условиях полунепрерывного культивирования дости- 40 гает 1,8 г/л или 180 г/м при выращивании в культиваторе с толщиной " слоя суспензии 10 см (объем суспензии при этом равен 100 л).

7 6

При ежесуточном изъятии части суспензии (257) продуктивность штамма составляет 45 г/м сут АСВ. Биомасса содержит, 7.,", белок 38; глицерин

Зб; р -каротин 8,2 или соответственно 17, 1 г/м сут белка, 16,2 г/м .сут глицерина и 3,7 г/м сут -каротина).

Благодаря более крупным размерам клеток биомасса предлагаемого штамма легко отстаивается, а для ее полного отделения от куль гуральной жидкости центрифугируют только 1/10-1/20 часть ее объема, содержащую клетки водоросли, а остальную часть среды используют повторно. Отделение биомассы известного штамма P.tenuis Massjuk требует центрифугирования всей суспензии.

Кроме того, культивирование D.salina Teod. CALU-834 возможно в средах, содержащих сточные воды животноводческих комплексов, а также в более широком диапазоне концентраций хлорида натрия (3-307). Использование повышенных концентраций хлорида натрия предотвращает развитие грибов, зооппанктона, ракообразных, представляющих серьвзную проблему при массовом купьтивировании водорослей.

Штамм Dunaliella salina TeodCALU-834 может быть использован для промышленного получения белка и р -каротина, а также глицерина.

Формула и з обре т е н и я

Штамм вольвоксовой водоросли

Dunaliella salina Teod, (коллекция водорослей Биологического научно-исследовательского института ЛГУ им. А.А. Жданова) CALU-834 — продуцент белково-каротиновой биомассы.