Способ определения концентрации иммунного комплекса и устройство для его осуществления

 

Изобретение относится к иммунохимии , в частности к колориметрическим способам и фотоэлектрическим устройствам , для оценки ферментативной актршности. Целью изобретения.является повышение чувствительности иммуноферментного анализа, а-также повышение чувствительности первичного преобразователя, упрощение конструкции устройства и уменьшение объема исследуемой пробы. Для этого фотометрирование проводят при длине волны 550-570 нм, при этом в качестве источника излучения используется светодиод, и в устройство введены логарифмирующий аналого-цифровой преобразователь отношения двух сигналов и стабилизированный генератор прямоугольных импульсов, выход которого соединен со светодиодом и запускающим входом аналого-цифрового преобразователя , причем первый вход преобразователя соединен с источником опорного напряжения, соответствующего нулевой концентрации, второй вход - с выходом усилителя. В основе способа лежит применение метода иммуноферментного анализа, при котором специфические антитела и антигены соединены с поверхностью твердой фазы путем адсорбции. Соединение ферментконьюгированных антител и антигена проводится прямым или непрямым вариантом . О количестве определенного вещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интенсивность окрашивания субстрат - индикаторного раствора. При использовании коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой наиболее доступными и . чувствительными субстратами являются 5-аминосалициловая кислота и ортофенилендиамин. 2 с.п. ф-лы, 2 ил. i (Я со о 00 м to СХ)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (su 4 G 01 N 21/41

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4061581/28-25 (22) 22. 04. 86 (46) 23.01.88. Вюл. N 3 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и конструкторский институт медицинской лабораторной техники и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почет. акад.Н.Ф.Гамалеи (72) Б.А.Ворогушин„ Г.А.Вильнер, . И.А.Кружалова, А.А.Опалев, И.С.Розен, И.Г.Баландин, И.П.Павлова и К.Л.Шаханина (53) 535.024(088.8) (56) Wisdam G.Â. Enzyme-Immunoassay.—

Clin. Chem, 22,8, 1976, р.!3431255, Патент США У 4357105, кл. G 01 N 21/25, 1982. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕJKHHR .КОНЦЕНТРАЦИИ

ИММУННОГО КОМПЛЕКСА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ

ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к иммунохимии, в частности к колориметрическим способам и фотоэлектрическим устройствам, для оценки ферментативной активности. Целью изобретения является повьппение чувствительности иммуноферментного анализа, а также повышение чувствительности первичного преобразователя, упрощение конструкции устройства и уменьшение объема исследуемой пробы. Для этого фотомет„„SU„„1368728 А1 рирование проводят при длине волны

550-570 нм, при этом в качестве источника излучения используется светодиод, и B устройство введенылогариф-. мирующий аналого-цифровой преобразователь отношения двух сигналов и стабилизированный генератор прямоугольных импульсов, выход которого соединен со светодиодом и запускающим входом аналого-цифрового преобразователя, причем первый вход преобразователя соединен с источником опорного напряжения, соответствующего нулевой концентрации, второй вход— с выходом усилителя. В основе способа лежит применение метода иммуноферментного анализа, при котором спе9 цифические антитела и антигены соединены с поверхностью твердой фазы путем адсорбции. Соединение фермент- С коньюгированных антител и антигейа проводится прямым или непрямо вариантом. О количестве определенного вещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интен- С сивность окрашивания субстрат — ин- ф .1 дикаторного раствора. При использова- QQ нии коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой наиболее доступными и, фф чувствительными субстратами являются

5-аминосалициловая кислота и ортофенилендиамин. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.

13687

Изобретение относится к области иммунох1ыии, в частности к области колориметрических способов и фотоэлектрических устройств для оценки ферментативной активности, предназначено для количественной оценки результатов различных вариантов иммуноферментного анализа (ИФА) при определении антигенов и антител к ним и мо- 10 жет быть использовано в лабораториях научно-исследовательских и лечебно профилактических учреждений различного профиля.

Целью изобретения является павы- !г шение чувствительности определения, и упрощение конструкции устройства, На фиг.1 представлены спектральные характеристики субстрат-индикаторного раствора 5-аминосалициловой кислоты," на фиг.2 — устройство для реализации способа.

Устройство включает в себя стабилизированный генератор 1 прямоугольных импульсов, источник излучения— светодиод 2 зеленого свечения, излучающий в области спектра 550-570 нм, кювету 3 с исследуемой пробой, приемник излучения — фотодиод 4, усили5, логарифмирующий аналого циф- ЗО ровой преобразователь 6 и блок 7 цифровой иицикации.

Способ осуществляется следующим

ООРаЗОМ.

Твердофазный носитель (шарыс из пслимера) вносят в 200 мкл раствора специфических антител (антигена) и инкубируют 2 ч прн 37 С или 16 ч при

4--6 C. От избытка несвязаьшихся антител {антигена) носитель отмывают фос- 40 фатно-солевым буферным раствором (ФСБР)с добавлением 0,05% твина-20.

Носитель " п1мобилизованными антителами (антигеном) вносят в исследуемую пробу, содержащую искомый антиген (антитело). После инкубации в течение 30 мин при 37 С твердофазный носитель отмывают от несвязавшихся реагентов ФСБР 0,05 твин-20.

Носитель, на поверхности которого находится комплекс антитело — антиген, вносят в 200 мкл раствора конъю(cDециФичеeI He н 1муноглобулин меченые ферментом — перексидазой).

После 30 мин контакта йри 37 С носитель промывают ФСБР + твин-20 от не\ связавше гося конъюгата.

Носитель, содержащий на поверхности комплекс антитело — антигенмеченое

28 2 антитело, вносят в 500 мкл субстратиндикаторного раствора {Орто-фенин "идиамин, 5-аминосалициловая кислота)..

Через 30 мин реакцию Останавливают добавлением в пробу равного Объема

1н.раствора серной кислоты или ЫаОН и субстрат индикаторный раствор фотометрируют при длине волны 550-570 им.

0 количественном -одержании искомого антигена — антитела судят по фер< мен тативн ой ак тив но с ти св я э а amer о ся фермента (разрушение ферментного субстрата, дающее окрашенный продукт) IIQ величине оптической плотности, Устройство, реализующее способ, работает следующим образом.

Сигналы с выхода генератора 1 поступают на светодиод, который излучает последовательность световых прямоугольных импульсов, проходящих через кювету с .субстрат-индикаторным раствором и падающих на поверхность фотодиода, Амплитуду тока питания в импульсе можно увеличить в 5-8 раз по сравнению с допустимой величиной постоянного тока питания светодиода.

При,цостаточно большой скважности (50-!00) средняя мощность, потребляемая светодиодом.,в 6-20 раз меньше, чем при постоянном токе питания. 0дновременно удается значительно увеличить мощность излучения светодиода в импульсе, так как она во=-растает по показательному закону с увеличением тока питания, В качестве фотоприемника может быть применен любой кремниевый фотодиод с малой площадью фоточувствительной площадки (2-3 мм ),. Схема усилителя является сравнительно прос=. той и не требует компенсацик. дрейфа нуля, так как усилитель работает ь импульсном режиме.

Сигнал с выхода усилителя по- гупает на вход логарифмируьющего .иалого цифрово. а преобразоьаIe.iz c. I meния, на другой вход которого 11оступает сигнал соответствующий зная--íию нулевой концентрации. Для ="-апуска преобр»з ° ватедя не 1 ребуется специ ь.иь:.ОЬ СХЕМЫ ЯаПУСКающИЕ :МПУЛЬСЫ

I;.t:ñ.".òóïeIñг с выхода генератора прямоугольных импульсов,, С выхода преобразозйтсля на вход блока индексации поступа. †:.т го::";..едова— телькОсть импульсов., чеслО KО rорых соответствует значен11ю oIIpeды::немой з 1З

1 оптической плотности субстрат-индикаторного раствора.

В основе способа лежит применение метода ИФА, при котором специфические антитела или антигены соединены с поверхностью твердой фазы путем адсорбции, ковалентно или другими методами. Соединение фермент-конъюги рованных антител и антигена проводится прямым или непрямым вариантом. 0 количестве определяемого вещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интенсивность окрашивания субстрат-индикаторного раствора. При использовании конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой наиболее доступными, дешевыми и достаточно чувствительными субстратами являются 5-аминосалициловая кислота и орто-фенилендиамин, При большйх разведениях раствора с увеличением длины волны имеются либо незначительные уменьшения оптических плотностей (разведение 1;8), либо оптические плотности практически не меняются (разведение l:16).

При этом оптическая плотность исходного субстрат-индикаторного раствора резко уменьшается с увеличением длины волны, С переходом в длинноволновую область спектра при малых концентрациях иммунологически активного вещества оптическая плотность раствора практически не уменьшается, при этом имеет место сужение динамического диапазона измеряемых оптических плотностей. В связи с этим для повышения чувствительности колориметрического метода при измерении малых концентраций целесообразен переход в длинноволновую область спектра с одновременным увеличением разрешающей способности первичного преобразователя.

При переходе на длинноволновую область спектра (=550-570 нм) удается упростить устройство, реализующее способ, так как в качестве источника излучения можно испольэовать светодиод.

Чувствительность способа (определяется выражением ь(= (1)

;где Т - светопропускание раствора;

К вЂ” концентрация.

68728

Анализ экспериментально обобщенных спектральных характеристик субстратиндикаторных растворов показал, что их оптическая плотность D может быть аппроксимирована выражением

D=D «„(f, (D4< )+f г(Р«,„.)е j, å (0,2),(2 коэффициент р имеют вид

20 11 1ъф50 (3)

f =1-f г

Л m m0,7.

Для раствора 0-фенилендиамина on25 тическая плотность аппроксимируется выражением, аналогичным (2), но с другими значениями коэффициентов f г

Светопропускание

-6g -"

Т 10-в 10 " < г ), (5) где E „ — коэффициент экстинции при

=450 нм.

Bd

35 Исследование функции показа3Q ло, что величина длины волны A макс при которой достигается максимум чувствительности, определяется форму40 лой,нм (6) макс =450+100

Hs расчетов по формуле (6) следу45 ет, что при уменьшении концентраций раствора от максимума до значения, соответствующего D «„=О, 5, уменьшается от 650 до 510 нм; для

0,1 (D <0,5 чувствительность а неэ0 начительно уменьшается при переходе с длины волны = 450 нм на длину волны Я =550 нм. Так, а „, =0,92 и о =Os 87 для D «5о =Os4s или с(«5о

1, 60, м, =1,54 при D „, =О, 15 °

Для D z, <0,1 чувствительность a не зависит от длины волны в диапазоне 450 — 650 нм.

При больших концентрациях целесообразен переход в длинно-волновую где D«, — оптическая плотность раст10 вора на длине волны 3 =

= 450 нм (для 5-аминосалициловой кислоты);

> -450

1= — — "текущее относительное из100 менение длины волны излу15 чения, Для раствора 5-аминосалициловой кислоты функции f» Ег и постоянный

13687 область спектра, причем оптимальная длина волны. меняется в зависимости от концентрации от 650 до 510 нм.

При переходе на эту длину волны

550-570 нм для D „ =2 чувствитель. ность увеличивается s 4 раза; для

Disa =1 — в I 5 раза; для Disa Ог5 чувствительность не меняется при переходе в укаэанную область спектра.

Таким образом, удается повысить чувствительность первичного преобразователя при малых светопропусканиях, что позволяет повысить отношение сиг- 16 нал/шум.

Ф о р м у л а и з обре т е н и я

1. Способ определения концентра- 20 ции иммунного комплекса антиген — антитело в субстрат-индикаторном растворе 5-аминосалициловой кислоты или орто-фенилендиамина, включающий зондирование раствора и регистрацию интенсивности прошедшего через него из.лучения, по которому судят о концент28 б рации, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, зондирование проводят на длине волны из диапазона 550570 нм.

2. Устройство для опоепеления концентрации иммунного комплекса, содержащее светодиод, вход которого соединен с источником питания, и расположенные по ходу излучения кювету для исследования вещества, фотодиод, выход которого соединен через усилитель с аналого-цифровым преобразователем, выход которого соединен с блоком цифровой индикации, и источник опорного напряжения, о т л и ч а ющ е е с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности измерения, упрощения конструкции, источник питания выполнен в виде генератора импульсов, аналого-цифровой преобразователь выполнен логарифмирующим, при этом источник опорного напряжения и генератор импульсов соединены с входами логарифмирующего аналого-цифрового преобразователя.

1368728

Составитель С.Голубев

Техред -М.Дидык Корректор Н.Король

Редактор Л.Гратилло

Заказ 282/43 Тираж 847 Подписное

ВНЛИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграФическое предприятие, г.ужгород,ул.Проектная,4