Способ определения концентрации микроорганизмов в суспензиях

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (11 4 С 12 Q 1 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . /

H АBTGPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

-- -". (21) 4114593/28-13 (22) 08.09.86 (46) 23.03.88. Бюл. Ф 11 (71) Всесоюзный научно-исследователь. ский институт биологического приборостроения (72) В.И. Оленев и II.A. Матысяк (53) 663.01(088.8) (56) Романенко В.И. и Кузнецов С.И.

Экология микроорганизмов пресных водоемов. — Л.: Наука, 1974, с.115II6. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

МИКРООРГАНИЗМОВ В СУСПЕНЗ11ЯХ (5 7) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при иммунофпуоре сцентном анализе при определении концентрации микроорганизмов. Цель изобретения — повышение достоверности способа и сокращение ! времени определения. Способ заключает ся в добавлении к суспензии клеток специфического люминесцирующего иммуно глобулина, введении полученной смеси в гель, нанесении микрообъема смеси на предметное стекло, выдерживании ее до начала полимеризации, накрывании покровным стеклом и выдерживании до затвердевания. Концентрацию микроорганизмов подсчитывают по формуле, приведенной в описании изобретения.

1382848

20! Где ! площадь покровного стекла, „г

5Π— площадь окулярной сетки, 25 приведенная к увеличению объектива, мм г.

25 — число полей зрения;

М вЂ” число клеток в 25 полях зрения каждого образца;

U — микрообъем смеси для одпр ного образца, мм; а — число разведенной суспензииъ

Š— погрешность результата из

10 образцов.

Пример 1. Определение концентрации клеток В,subfl!3s в суточной бульонной культуре.

Суточную культуру В с su bf 1 i sр Вы40 ращенную в мясопептонном бульоне, объемом 3. мл помещают в кювету (тол— шиной 1 см) спектрофотометра и измеряют плотность на длине волны 600 им, величина которой составляет больше

3 ед.оптической плотности. Культуру

45 разводят физиологическим раствором (0,85Х-ным NaC3 ) в 20 раз и измеряют оптическую плотность, которая составляет 0,36 ед. оптической плотности.

К 3 мл полученной суспензии добавля- 50 ют 0,375 мп люминесцирующего иммуноглобулина, специфического к B, subf 3 l i s разведена 1: 8. После проведения (15 мин) иммунофлуоресцентной реакции в полученную смесь добавляют 55

0,3 мл деэоксихолата (0,3 мг/мл), переворачивают закрытую пробирку несколько раэ без образования пены.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при иммунофпуоресцентном анализе микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение достоверности способа и сокращение времени определения.

Способ заключается в том, что в суспензию клеток добавляют специфи — 1О ческий люминесцирующий иммуноглобулин, полученную смесь вводят в гель, микрообъем смеси наносят на предмет— ное стекло, выдерживают до начала по- лимеризации, накрывают покровным 15 стеклом и выдерживают до затвердевания без образования пустот и подсчитывают число микроорганизмов (кл/мл) по формуле

S< Ма

N = +E

So 25-Unp

0,3 мл полученной смеси добавляют к 2,7 кп геля. Затем на обезжиренное предметное стекло наносят по две капли смеси по 3 мкл, после 3 мин выдерживания каждую каплю накрывают покровным стеклом толщиной 0,15 мл размером lбхlб мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на пяти мазках: 90,0, 89, 87, 100, 82. Среднее число клеток составляет (в 25 полях зрения) М = 91+3.

Концентрация В. subf ilis

N = +f = (7 5+02)»

5,. M a

5он 25 Ч„р х 1 0 KJI / MJI .

Время анализа 30-40 мин.

Пример 2. Подсчет клеток кишечной палочки М17 в препарате

Бификол.

4,5 мп неразведенной суспенэии препарата Бификол, содержащего клетки кишечной палочки М17 ибифидобакте« рии, соединяют с 0,6 мл люминесциру-, ющеro иммуноглобулина, специфического к кишечной палочке разведения 1:8.

После проведения иммунофлуоресцентной реакции 15 мин в полученную смесь добавляют 0,45 мл дезоксихолата (0,3 мг/мл), несколько раз (герметично закрытую) пробирку переворачивают беэ образования пены, 4,2 мл полученной суспензии добавляют в используемый в данном случае полиакриламидный гель вместо дистиллированной воды. Затем на обезжиренное стекло наносят 2 капли смеси по 3 мкл, после

3 мин выдерживания каждую каплю накрывают покровным стеклом толщиной

0,15 мм, под которым через 7 мин образовывается эастеклованная проба, занимающая камеру размером 16xl6x0, 01103 мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на

:шести мазках: 15, 20, 17, 16, 13, 16.

Среднее число клеток в 25 полях зрения мазков M = 15+2. Концентрация кишечной палочки М17 в препарате Бификол

N = +f = (1,7-0,2j

S „25 V„p

«10 кл/мл.

Время анализа 30-40 мин.

Клетки бифидобактерий не мешают количественной оценке клеток кишечной палочки из-за специфического окрашивания только клеток кишечной палочки, 1382848

91+4. "=5 2 Ч +Г = (102+

5о«25 1/ор

+ 0,04) -10 кл/мл.

Время анализа 30-40 мин.

Используемый гель должен удовлетворять следующим условиям: не обладать собственной люминесценцией при возбуждении в диапазоне длин волн

400-500 нм, не тушить люминесценцию красителя, образовывать после полимериэации прозрачное стекловидное тело, не должен содержать посторонних включений, образование застеклованного тела должно заканчиваться в течение 7 — 10 мин.

Таким требованиям отвечает, например, полиакриламидный гель, состо. ящий иэ акриловой кислоты амид (СН -CHCONH <), персульфата аммония (NH )g S g0>) > додецилсерной кислоты натриевая соль ДЦС (CH з(СН )„0SÎ Na)

N,N" -метилен-бис-акриламида (СН (ИНОССН=СН ):) И,М, Н,Н -тетраметилэтилендиамина ((СН ) NC H

Для работы готовят раствор А: в 25 мл дистиллированной воды растворяют 1 85 r трис-HCI, 7,7 r трис- 55

ОН, 0,2 r ДДС, после растворения объем доводят до 50 мл; раствор В: в 50 мл дистиллированной воды раст35

Пример 3. Подсчет общего числа микроорганизмов в препарате Г>ифи- кол с помощью не специфического окрашивания клеток микроорганизмов.

4, 5 мл нер аз веде нной суспензии препарата Бификол смешивают с 0,5 мп

ФИТЦ (флуоресцеин изотиоцианат изамер 1). Исходный раствор ФИТЦ 1 мг-мл рН 8,0 инкубируют 10 мин. К получен- 10 ной смеси добавляют 0,45 мл деэоксихолата (0,3 мг/мл), 4,2 полученной суспензии добавляют в используемый в данном случае полиакриламидный гель вместо дистиллированной воды. 15

Затем на обезжиренное стекло наносят по 2 капли смеси по 3 мкл. После

3 мин выдерживания каждую каплю накрывают покровным стеклом толщиной

0,15 мм размером 16х16 мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на шести мазках: 86, 95, 87, 101, 91. Среднее число клеток в 25 полях зрения мазков И = воряют 14,6 r акриламида, 0,4 r бис-акриламида; раствор С: готовый раствор ТЭИЭД(И,Й,11,N -тетраметилэтилендиамин); раствор 0: в 2 мл дистиллированной воды растворяют 200 мг персульфата аммония.

Для приготовления геля смешивают растворы А, В> С, 0 в следующем порядке: 2,5 мл раствора Я, 3,3 мл раствора В, доводят дистлиллированной водой до 10 мл, 5 мкл раствора С, 50 мкл раствора О.

Концентрация клеток после суммарного разведения П исходной суспен-.

У

П = П,П П П где П, — разведение исходной суспенэии фосфатным буфером до оо = 0,2-0,5;

П вЂ” разведение люминесцирующим иммуно гло булином;

II> — разведение дезоксихолатом;

П вЂ” разведение гелем, 4

6 8 должна составлять 5 10 ... 10 кл/мл.

Изобретение может быть использовано при нормировании приборов, предназначенных для счета клеток в суспензиях, концентраторов, приборов, используемых для контроля загрязнений окружающей среды микробиологическими предприятиями. Кроме того, способ может быть использован для определения количественного и качественного составов клеточных суспенэий в готовых формах вакцин и препаратов.

Фор мул аиэобретения

Способ определения концентрации микроорганизмов в суспензии, предусматривающий окрашивание ее, разбавление, фиксирование клеток к среде, нанесение суспензии на предметное стекло с последующим микроскопированием, отличающий с я тем, что, с целью повышения достоверности способа и сокращения времени определения, суспенэию клеток разбавляют физиологическим раствором, содержащим 0,857-ный хлористый натрий, до концентрации 10 — 10 кл/мл, добавля8 ют люминесцирующий иммуноглобулин, специфический к данному микроорганизму, и полученную смесь инкубируют до завершения иммунофлюоресцентной реакции, добавляют к ней дезоксихолат

1382848

Составитель Л. Борисова

Техред Л Олийнык Корректор И.. 1рлейн

Редактор H. Гунько

Заказ 12б3/22 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 и полимерный гель„ а перед микроскопированием смесь, нанесенную на предметное стекло, выдерживают до начала полимеризапии, накрывают покровным стеклом и выдерживают lo затвердев ания.