Способ получения антигена риккетсий

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении диагностических и профилактических препаратов. Цель изобретения - повышение степени очистки и выхода антигена на стадии очистки. Сущность способа сводится к тому, что риккетсии культивируют в куриных эмбрионах, полученную биомассу риккетсий инактивируют, затем гомогенизируют. Полученный гомогенат центрифугируют и осадок последовательно обрабатывают трипсином, затем после удаления трипсина - раствором ПЭГа в присутствии натрия сульфат декстрана, далее после центрифугирования супернатант обрабатывают хлороформом. Получают 3,5-4 мг чистых риккетсий, содержание белка снижено по сравнению с исходным более чем в 50 раз.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения очищенных риккетсий как основы для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Целью изобретения является повышение степени очистки и выхода антигена на стадии очистки. П р и м е р 1. 6-7-дневные куриные эмбрионы заражают в желточную оболочку культурой риккетсий Провачева в дозе 0,5 мл в разведении 1:100-1:500 в зависимости от накоплений риккетсий. Зараженные эмбрионы культивируют при температуре +35^oC. Овоскопируют на 4-й день, погибшие уничтожают. Начиная с 5-го дня овоскопию проводят ежедневно утром и вечером, отбирают павшие куриные эмбрионы, вскрывают, извлекают желточные оболочки и делают мазки для контроля накопления риккетсий. Желточные оболочки с риккетсиями замораживают при температуре -20^oC и ниже. После размораживания к желточным оболочкам весом в 40 г добавляют 120 мл 1 М КСl c 0,4-0,5% содержанием фенола, выдерживают сутки при комнатной температуре для инактивации риккетсий. Затем материал подвергают гомогенизации при 22000 об/мин в течение 1 мин в блендере. Суспензию центрифугируют при 10000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок тщательно растирают, добавляя 60 мл подогретого при +37^oC 0,5-0,75% раствора трипсина, размельчают 1 мин в блендере при 22000 об/мин и трипсинизируют на магнитной мешалке или в водяной бане при +37^oC в течение 20-30 мин. Добавляют 100 мл раствора хлористого натрия и центрифугируют при 10000 об/мин 30 мин. Осадок тщательно растирают, добавляют 40 мл раствора хлористого натрия, размельчают в блендере при 22000 об/мин 1 мин и доводят до 1000 мл предварительно приготовленным стерильным 6% раствором хлористого натрия (60 г на 1 л дистиллированной воды) рН 7,2-7,4. Добавляют 60-70 г ПЭГ м.в. 6000 или мол.в. 4000, перемешивают до полного растворения и добавляют 2 г натрия сульфат декстрана 500, тщательно перемешивают до его растворения. Помещают на 30 мин при +4^oC. Затем центрифугируют при 2500 об/мин 30 мин. После центрифугирования отсасывают от осадка и добавляют 100 мл хлороформа, встряхивают, центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, а затем осторожно отбирают надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость центрифугируют при 10000 об/мин 30 мин. Осадок тщательно растирают, добавляя 80 мл раствора хлористого натрия, центрифугируют при 10000 об/мин 30 мин. Эту операцию с новыми его порциями повторяют еще 1-2 раза, получая в конце осадок чистых риккетсий. Чистоту риккетсий устанавливают исследованием их сероиммунологическими (РСК, иммуноферментным методом и иммунизацией свинок), биохимическими (содержание белка по Лоури) и электронномикроскопическим методами. В РСК, иммуноферментном методе и в опыте иммунизации животных в целевом продукте не определены белки из желточных оболочек куриных эмбрионов. Содержание белка в целевом продукте по сравнению с исходным снижено более чем в 50 раз при возрастании специфического титра (в 18-16 раз), при электронной микроскопии в целевом продукте отсутствуют какие-либо примеси при полной сохранности оболочек риккетсий. Риккетсии, полученные по прототипу, в ряде серий содержат антиген из желточных оболочек, выявляемый иммуноферментным методом в титрах 1:200-1: 500, или у единичных иммунизированных свинок в РСК обнаруживают антитела в титре 1:10. Из одного грамма овокультуры риккетсий получают 3,5-4 мг чистых риккетсий (влажного веса), по прототипу 2,5-2,8 мг. П р и м е р 2. 5-6-дневные куриные эмбрионы заражают в желточную оболочку овокультурой риккетсий Сибирика в дозе 0,5 мл в разведении 1:5-1:50 в зависимости от накоплений риккетсий. Зараженные эмбрионы культивируют при +33^oC. Овоскопируют их со 2-го дня. Эмбрионы, погибшие на 3-5 cутки, оставляют при комнатной температуре на 24-48 ч с целью накопления в них риккетсий. Затем их вскрывают, извлекают желточные мешки, готовят из них мазки для микроскопии и при наличии риккетсий желточные оболочки хранят при -20^oC или ниже. Далее очистку риккетсий осуществляют по примеру 1, используя 7-8% ПЭГ мол.в. 4000 или 6000. Выход целевого продукта из 1 г овокультуры риккетсий Сибирика колеблется в пределах 2,9-3,6 мг влажного веса риккетсий. Исследование полученных суспензий риккетсий Сибирика сероиммунологическими и электронно-микроскопическими методами не выявило балластных белков желточных оболочек. По сравнению с исходным продуктом содержание белка снижено в 10-15 раз при повышении специфического титра в 16 раз (исходная овокультура риккетсий Сибирика содержит в 3-4 раза меньше белка по сравнению с другими видами риккетсий из-за ранних сроков гибели куриных эмбрионов на 3-4 дня). Испытание напряженности иммунитета у морских свинок, иммунизированных антигенами из риккетсий Провачека, Сибирика и Музера показало невосприимчивость животных к заражению 1000 инфекционных доз этих же вирулентных риккетсий. Очищенная суспензия риккетсий может служить исходным продуктом для производства различного типа корпускулярных или синтетических профилактических препаратов.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА РИККЕТСИЙ путем культивирования риккетсий в куриных эмбрионах, анактивации и гомогенизации полученной биомассы с последующим центрифугированием гомогената и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки и выхода антигена на стадии очистки, после центрифугирования гомогената полученный осадок последовательно обрабатывают 0,3 1%-ным раствором трипсина, 4 10%-ным раствором полиэтиленгликоля с мол. в. 4000 или 6000 в присутствии 0,1 0,4% на объем суспензии натрия сульфат декстрана 500 и затем 5 15% хлороформа.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---