Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата

 

Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности для изготовления твердых сыров. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента гатамма М-81 сапрофитного дереворазрушающего базидиального гриба Hirschioporus laricinus ВКПМ F -263, культивируемого на глюкозопептонной среде, охлаждения её до температуры 4-5°С, осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от . низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в .воде, методом r ta- ЛИЗ а против охлажденной дистилл11рованной воды при температуре и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Активность ферментного препарата 1700 000 ед/г. I (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (gg 4 С 12 N 9/58

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4153167/31-13 (22) 29.08.86 (46) 15.05.88. Бюл, Р 18 (71) Донецкий государственный универ" ситет (72) М.И. Бойко, С.Ф. Негруцкий и Т.В.Мирошниченко (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

9 1110801, кл. С 12 N 9/58, 1982 °

Авторское свидетельство СССР

Р 1211288, кл . С 12 N 9/58, 1984. .(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВА10111ЕГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА (57) Изобретение может быть использовано в пищевой промьппленности для изготовления твердых сыров. Цель изобретения " повьнпение активности целеÄÄSUÄÄ 1395672 А1 вого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента штамма М-81 сапрофитного дереворазрушающего базидиального гриба

Hirschioporus laricinus ВКПМ F-263, культивируемого на глюкоэопептонной среде, охлаждения ее до температуры

4-5 С осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-80Х-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в .воде, методом г ализа против охлажденной дистилл рованной воды при температуре 4-5 С и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Актив/ ность ферментного препарата

1700 000 ед/г.

С:

1395672

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, в частности молокосвертывающего фермента, путем культивирования сапрофитного дереворазрушающего базидиального гриба Hirschioporus lari cinus (Karst,)

RyU.Hà жидкой питательной среде. Полученный ферментный препарат может быть использован в качестве заменителя сычужного фермента — реннина, при производстве твердых сыров.

Целью изобретения является повьш ение активности целевого продукта и упрощение процесса. l5

Способ состоит в следующем.

Итамм Hirschioporus laricinus BKIIN

F-263 (И-81) культивируют на каждой питательной среде следующего состава, г/л: 70

Глюкоза 10,0

Пептон 3,0

К,НР04 0,4

КН,Р04 0,6

И880, 7Н,О 0,5 25

Кп80< l 7Í О О, 001

СаСl 0,05

Дистиллированная вода до 1 л.

Питательную среду разливают в конические колбы и стерилизуют в авто- 30 клаве под давлением 1 атм в течение

40 мин. Кислотность среды после стерилизации составляет 4,5-5,5 рН. Посевной мицелий выращивают на агаризированной глюкоэокартофельной среде, 35 сусло-агаре и на жидкой питательной среде. Инкубируют штамм И-81 в термостате ТС-80М при 30 С.

NaKсимальная молокосвeртывающая активность у штамма М-81 на среде с Щ глюкозой наблюдается на 10-15 сут роста, затем несколько снижается и к

30 сут падает в 3 раза.

Осаждение белков по фракциям из культурального фильтрата осуществляют путем увеличения концентрации сернохислого аммония íà IОХ. Фракцию белка, выпавшую в осадок, отцентрифугировывают на рефрижераторной центрифуге в течение 15 мин при 4-5 С и о 50 подвергают первичной очистке с помощью диализа против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. В качестве полупрони-:: цаемой мембраны используют целлафановую пленку, поры которой пропускают вещества с молекулярным весом до

7000-10000.

Белки, обладающие молокосвертывающей активностью, подвергают дальнейшей очистке с помощью метода электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Полученный водорастворимый белок вносят в количестве О, 1 мп в каждую ячейку верхнего геля. Их в приборе 46. Для электрофоретического разделения белков используют 7,5%-ный щелочной гель. В щелочном геле белки мигрируют к аноду, поэтому нижний электрод камеры подключают к гнезду выпрямителя (УИП), имеющему знак плюс(+). Верхний электрод присоединяют к знаку минус (-).

В начале электрофореза, до вхождения индикаторной краски в разделяющий гель, поддерживают ток 80 мА при напряжении 210 В, Затем повышают ток до

180 мА при напряжении 470 В. Заканчивают фракционирование белков при подходе индикаторной краски к нижнему краю разделяющего геля. Злектрофорез длится примерно 3 ч. Затем сняв боковые стекла прибора, срезают концентрирующий гель и вынимают из кювет пластинки разделяющего геля. Для определения электрофоретической подвижности молокосвертывающего фермента отрезают три ячейки разделяющего геля и фиксируют 7Х-ным раствором трихлоруксусной кислоты в течение 20 мин.

Затем отмывают гель от трихлоруксусной кислоты дистиллированной водой (трижды по 10 мин) и окрашивают в течение ночи в 0,02Х-ном растворе красителя Кумасси ярко-голубой Г-250, приготовленного в смеси этиловый спирт — вода — уксусная кислота (10:30:I). Избыток красителя отмывают раствором, состоящим их этой же смеси растворителей. Отмытый от красителя гель используют для определения относительной электрофоретической подвижности зон молокосвертывающего фермента и служит эталоном для выявления локализации фермента в пластинках геля, не подвергшихся фиксации и окраске красителем. Отмытый гель накладывают на пластинки разделяющего геля и отмечают место нахождения зон молокосвертывающего фермента, которые вырезают, объединяют, замораживают и растирают в ступке ° Ðàñтертую массу заливают холодной дистиллированной водой для экстракции белков, которая длится в течение 2-.

3 ч. Затем гомогенат центрифугируют

139 в центрифуге (8000 об/мин) при 4-5 (; в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофильной сушке. Полученный препарат имеет вид порошка светло-кремового цвета, хорошо растворимого в воде. Молокосвертываищая активность этого препарата составляет 1700000 ед/г.

Пример. Выращивание штамма

М-81 осуществляют в конических колбах на 1 л, содержащих 300 мл стеральной глюкозопептонной среды с рН

4,5-5,5 в термостате при 30 С поверхностным способом в течение 10 сут.

Культуральный фильтрат отделяют от мицелия путем фильтрования через бумажный фильтр (синяя лента). Затем фильтрат охлаждают в холодильнике до

4 С и осаждают ферментный препарат сернокислым аммонием. Молокосвертывающий фермент находится во фракции белка, осаждаемой от 55 до 80Х-ного насыщения фильтрата сернокислым аммонием. Выпавший в осадок белок центрифугируют и диализируют против охлажденной дистиллированной воды в холодильнике в течение 18 ч. Затем диализируемую смесь переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при

8000 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость содержит молокосвертывающий фермент, который подвергают дальнейшей очистке методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля.

Надосадочную жидкость сливают и подвергают лиофипьной сушке. Полученный препарат имеет вид порошка светлокоричневого цвета, хорошо растворимого в воде. Молокосвертывающая ак.тивность этого препарата составляет

1700000 ед/г.

Молокосвертывающая активность ферментного препарата определяют IIQ методике, предложенной Каваи и Мукаи.

Для этого в 100 мп натурального молока вносят 1 мл 15Х-наго раствора

СЯС1, тщательно перемешивают и доводят кислотность субстрата с помощью

10 -ного раствора HCl до 6,0-6,1 рН.

Затем берут по 10 мп молока в пробирки и нагревают в водяной бане до о

35 С. После этого в каждую пробирку . добавляют 1 мл О, l -ного водного раствора ферментного препарата. Смесь в пробирках встряхивают и снова стао вят в водяную баню при 35 С. В момент встряхивания пускают секундомер

5672

4 и начинают отсчет времени, который заканчивают при появлении в пробирках плотного сгустка. Время, затраченное на образование сгустка, условно считают молокосвертывающей активностью, выряженной в минутах,За единицу молокосвертывающей активности принимают количество фермента, необходимое для свертывания 100 мл молока за 40 мин о при 35 С и рассчитывают по формуле, 40-100 К

МСА = — — — — -- ед/г препарата t д ю где К вЂ” коэффициент разведения препа15 рата фермента;

t — время, в течение которого из

100 мл молока при добавлении

1 мл, О,l -ного раствора фермента образуется плотный сгустокр мин

40 — среднее время свертывания молака при производстве сыра, MHH

ot, — навеска ферментного препара25 та, в r.

Для осаждения молокосвертывающего фермента из культурального фильтрата используют сернокислый аммоний, обладающий стабилизирующим действием на ферменты и все операции по выделению и очистке молокосвертывающего препарата не требуют отрицательных низких температур.

Культуряльный фильтрат штамма М-81

Hirschioporus laricinus патогенными

35 токсичными свойствами по отношению к беспородным белым мьппам обоего пола не обладает.

40 Формула изобретения

Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата, предусматривающий поверхностное культивирование продуцента Hirschioporus lari4 cinus ВКЛМ F-263 на глюкоэопептонной питательной среде до достижения максимальной активности, отделение мицелия фипьтрованием, осаждение фермента сернокислым аммонием и очистку, 5О отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и упрощения процесса, фильто рат охлаждают до 4-5 С, осаждение ведут при 55-80 -ном насыщении, а очистку сначяля диализом IIpoTHS охлаж» денной дистиллированной воды при 4о

-5 С, затем методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля.