Способ получения овомукоида

 

Изобретение относится к биохимии и медицинской промышленности и может быть использовано в препаративной и аналитической биохимии, химии медико-биологических полимеров и в медицине для извлечения протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая и кровь. Изобретение позволяет повысить выход овомукоида и степень его очистки до 85-91%, а также расширить спектр ингибирующих ферментов, что достигается использованием белка утиных яиц, смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном соотношении 1:1,8-2,3 и добавлением к фильтрату этанола при объемном соотношении этанола и фильтрата 3- 3,5:1. о (О Ф (Л с:

О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111

А1

А)1 4 С 07 К 3/02

« ф г:- .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4108343/31-13 (22) 20,06,86 (46) 23.06.88. Бюл. )) 23 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха, МГУ нм. М.В.Ломоносова, Минский государственный медицинский институт, Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева (72) Т.А.Валуева, Л.И.Григорьева, В.В.Мосолов, Н.А.Платэ, Л.И.Валуев, В.А.Синани, В.В.Чупов, Л.B.Hèêîëàéчик, Л.И.Мазур, В.В. Николайчик, В.М.Царенков, Г.Б.Храменко, А.В.Какарека и В.И.Ромашкин (53) 66.097.7(088.8) (56) Валуева Т.А. и др. Свойства и применение иммобилизованного овомукоида из белка утиных яиц. Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. — Олайне, 1985, с. 348.

Авторское свидетельство СССР

У 1137388, кл. G 01 N 33/50, 1982, Авторское свидетельство СССР

У 1114039, кл. С 08 F 291/00, 1983, Lineweaver Н., Murray С.W. Identification of the trypsin inhibitor

of egg white with ovomucoid

Biol. Chem., 1947, v. 171, р. 565 58). (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОМУКОИДА (57) Изобретение относится к биохимии и медицинской промышленности и может быть использовано в препаративной и аналитической биохимии, химии медико-биологических полимеров и в медицине для извлечения протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая и кровь.

Изобретение позволяет повысить выход овомукоида и степень его очистки до

85-91%, а также расширить спектр ингибирующих ферментов, что достигается использованием белка утиных яиц, смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном соотношении ):1,8-2,3 и добавлением к фильтрату этанола при объемном соотношении этанола и фильтрата 33,5:1.

1404513 о

Изобретение относится к области-биохимии и медицинской промышленности, а именно к способу получения овомукоида, который является эффективным ингибитором протеолити:еских ферментов и используется для создания биоспецифических сорбентов для извлечения протеолитических ферментов из различных биологических жидкостей, включая кровь.

Цель изобретения — повышение выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширение спектра ингибируемых ферментов. 15

Способ состоит в добавлении к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделении образующегося 20 осадка фильтрованием при 0-5 С, добавлении к фильтрату органического растворителя, удалении надосадочной жидкости декантированием, диализе осадка против дистиллированной воды и 25 высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют этанол, а в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, причем к белку утиных яиц добавляют смесь 0,5 М вод- 30 ного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,82,3, к фильтрЬту этанол добавляют при объемном отношении этанола и фильтрата 3-3,5:1 и высушивают, высушивание овомукоида проводят лиофильно.

Добавление к белку утиных яиц смеси 0„5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8-2,3 приводит к более полному осаждению балластных белков, чем в известном способе, Использование этанола на последующей стадии осаждения овомукоида обеспечивает более полное осаждение и увеличение выхода овомукоида. Обязательным условием полного осаждения овомукоида является наличие в фильтрате вводимой на первой стадии смеси водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола. При этом наиболее оптимальные параметры процесса (по выходу овомукоида и по степени его чистоты) достигаются только при использовании указанных соотношений. Уменьшение количества вод55 ного раствора трихлоруксусной кислоты приводит к увеличению содержания балластных белков в овомукоиде (степень чистоты овомукоида при соотношении

0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола 1:2,4 составляют 82Ж), а увеличение этого количества до соотношения 1 1,7 приводит к снижению выхода овомукоида до 0,8 г на 100 мл яичного белка.

Уменьшение количества добавляемого к фильтрату этанола также приводит к снижению выхода овомукоида (до 0,7 г на 100 мл яичного белка при объемном отношении этанола и фильтрата 2,9:1), а увеличение количества этанола приводит к его непродуктивному расходу практически без изменения выхода и степени чистоты овомукоида.

В отличие от куриного, получаемый по предлагаемому способу овомукоид из белка утиных яиц содержит два антитриптических центра и один антихимотриптический центр и 1 мг этого овомукоида способен ингибировать активность 1,95 мг трипсина (в том числе человека) и 0,97 мг химотрипсина. Кроме того, этот овомукоид способен ингибировать активность бактериальной, панкреатической и лейкоцитарной эластазы в количестве до 0,9 мг эластазы на 1 мг овомукоида.

Пример 1, Яйца утки разбивают и отделяют белки. К 300 мл бело ка при 20 С и перемешивании добавляют 300 мп смеси 107,14 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 192,86 мл этанола (объемное отношение l:1,8).

После добавления всего количества смеси реакционную массу перемешивают

30 мин, Выпавший осадок отфилыгровыо вают при 0 С и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мп этанола (3,5 объема на 1 объем фильтрата) и смесь оставляют на сутки при 0 С для полного выделения осадка овомукоида. Затем надосадочную жидкость удаляют декантированием, осадок переносят в диализный мешок и диализуют против дистиллированной воды в течение

2 сут. В результате диализа осадок растворяется, образуюп;ийся раствор переносят из диализного мешка в колбу и лиофильно сушат.

Степень чистоты овомукоида определяют путем пропускания раствора овомукоида в трис-буфере (рН 8,0), содержащем 0,2 М СаС1, через колонку с иммобилизованным на сефарозе трипсином и нахождением количества связанного белка (овомукоида) и бел14045 ) 3

Это позволяет более эффективно использовать исходное сырье (утиные яйца) и снизить стоимость как самого овомукоида, так и материалов, синтезированных с его применением (гемосорбентов и гемосовместимых полимеров).

Формул а изобретения

Составитель Н,Ходарев

Редактор Н.Яцола Техред М. Ходанич

Корректор В.Бутяга

Заказ 3056/26

Тираж 348 Подписное

В!1ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ка, прошедшего через колонку (балластные белки). Степень чистоты овомукоида равна 91Х, выход 2,68 г, т.е.

0,89 r на 100 мл яичного белка.

Пример 2, Процесс проводят по примеру 1, но используют 300 мл смеси 90,91 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и

209,09 мл этанола (объемное отношение 1:2,3), фильтрование проводят при

5 С и к фильтрату добавляют 1650 мл этанола (3 объема на 1 объем фильтрата).

Степень чистоты овомукоида равна

85Х., выход 3,19 г, т.е. 1,06 r на

100 мг яичного белка.

Пример 3. Процесс проводят по примеру 1, но в качестве исходного сырья используют замороженные при 20

-12 С белки утиных яиц. Белки размораживают и на 100 мп белков используют 100 мп смеси 35 мп 0,5 M водного раствора трихлоруксусной кислоты и

65 мп этанола (объемное отношение 25

1:1,86), фильтрование проводят при

5 С и к фильтрату добавляют 550 мп этанола (3,1 объема на объем фильтрата).

Степень чистоты овомукоида равна 3р

87Х, выход 0,93 г на 100 мл яичного белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход овомукоида с 0,65-0,72 до 0,89-1,06 г на

100 мл яичного белка и повысить степень чистоты овомукоида с 80 до 85-91Х, l

Способ получения овомукоида, предусматривающий добавление к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделение образующегося осадо ка фильтрованием при 0-5 С, добавление к фильтрату органического растворителя, удаление надосадочной жидкости декантированием, диализ осадка против дистиллированной воды и высушивание овомукоида, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширения спектра ингибируемых ферментов, в: качестве органического растворителя используют этанол, в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, к которому добавляют смесь 0,5 M водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8-2,3, а к фильтрату этанол добавляют при объем- . ном отношении этанол:фильтрат 3-3,5:1 и высушивание овомукоида проводят лиофиг=ьно,