Способ получения лимонной кислоты

 

Изобретение относится к микробиологической и пищевой отраслям промышленности и касается получения лимонной кислоты, используемой в пищевой промышленности, путем культивирования гриба продуцента Aspergillus niger на углеводсодержащих средах. Целью изобретения является повышение выхода лимонной кислоты. Способ заключается в том, что в процессе ферментации в начале стационарной фазы осуществляют снижение уровня растворенного кислорода в среде с 6 до 0,05 0,02 г/л ч при одновременном понижении температуры с 32 до 21 23°С с последующим выдерживанием в таких условиях в течение 2 2,5 ч. После этого в среду вводят водный раствор со следующим содержанием солей, г/л среды: NH₄Cl 0,05 - 0,07; NaHCO₃ 0,05 0,07; KCl 0,005 0,007; MgSO₄ 0,005 0,007; MnSO₄ 0,002 0,004; ZnSO₄· 7H₂O O 0,005 0,007; ЭДТА 0,005 0,007, и продолжают ферментацию в оптимальных условиях аэрации и температуры (6 г/л·ч и 32°C).

Изобретение относится к микробиологической и пищевой отраслям промышленности и касается получения лимонной кислоты, используемой в пищевой промышленности, путем культивирования гриба-продуцента Aspergillus niger на углеводсодержащих средах. Целью изобретения является повышение выхода лимонной кислоты. Способ заключается в следующем. Приготавливают углеводсодержащую питательную среду. Засевают ее грибом-продуцентом и выращивают в оптимальных условиях аэрирования и температурного режима. В процессе ферментации осуществляют снижение уровня растворенного кислорода в среде до 0,05-0,2 г/л ч при понижении температуры среды до 21-23^оС с последующим выдерживанием при таких уровне и температуре в течение 2-2,5 ч, а по окончании выдерживания осуществляют введение в среду водного раствора со следующим содержанием питательных солей на 1 л среды, г: NH₄Cl 0,05-0,07; NaHCO₃ 0,05-0,07; KCl 0,005-0,007; MgSO₄ 0,005-0,007; MnSO₄ 0,002-0,004; ZnSO₄ ˙7H₂O 0,005-0,007; ЕДТА 0,005-0,007, и продолжают ферментацию в оптимальных условиях аэрации и температуры. После окончания процесса выделяют целевой продукт. В процессе проведения ферментации вследствие усиленного нарастания биомассы происходит резкое загустевание культуральной жидкости (содержание сырой биомассы в метре среды возрастает с 25-30 до 40-50 г/л), нарушается кислотообразующая активность единицы биомассы (удельная кислотообразующая активность) и появляется необходимость в регуляции с целью интенсификации процесса биосинтеза. Как правило, это происходит на вторые сутки от начала ферментации при переходе культуры в стационарную фазу. Периодическое понижение температуры до 21-23^оС в условиях дефицита кислорода О₂ 0,05-0,2 г/л ч позволяет регулировать рост биомассы, снизить активность дыхания гриба, затормозить его развитие без необратимых нарушений основных метаболических процессов. Предлагаемые температурный (21-23^оС), кислородный (0,05-0,2 г/л˙ч) и временной (2-2,5 ч) режимы обеспечивают оптимальные условия сохранения основных жизненных функций гриба и, как следствие, сохранение его высокой кислотообразующей активности. Выход параметров (концентрация О₂, t^оС, время) за пределы оптимального диапазона приводит к снижению выхода целевого продукта. Введение водного раствора питательных солей по окончании выдерживания позволяет значительно интенсифицировать цикл трикарбоновых кислот, восполнить дефицит азота, предотвратить старение и автолиз мицелия. Изменение концентраций питательных солей в ту или иную сторону снижает положительный эффект от их введения. Максимальное увеличение выхода лимонной кислоты достигается только при совокупности операций. Одно лишь введение водного раствора питательных солей незначительно увеличивает выход лимонной кислоты так же, как и изменение только температурного и кислородного режимов. В качестве продуцентов используют штаммы Aspergillus niger 288/9, Л-1 или Л-4 (ВКПМF-171). П р и м е р 1. Ферментация периодическим способом в соответствии с технологической инструкцией (контроль). Ферментацию проводят в металлостеклянных ферментаторах мешалочного типа емкостью 26 л каждый. Продуцентом служит плесневый гриб Aspergillus niger ВКПMF-171. Выращивание посевного материала культуры продуцента осуществляют в среде следующего состава, г/л: Меласса 30,0 NH₂CL 2,2 KH₂PO₄ 0,16 MgSO₄ ˙7H₂O 0,25 ZnSO₄ ˙7H₂O 0,005 Ферментацию проводят в условиях аэрации при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л ˙ч и 32^оС. Состав среды для ферментации, г/л: Меласса 30,0 NH₂Cl 1,7 KH₂PO₄ 0,12 ZnSO₄ ˙7H₂O 0,005 Для обработки 300 г мелассы используют 1,6 г желтой кровяной соли и 0,5 н. щавелевокислый аммоний, ферментацию ведут в течение 5 сут. Объем лимонной кислоты составляет 11,91 кг/м³ за 1 сут (100%). П р и м е р 2. Условия подготовки и проведения ферментации аналогичны условиям примера 1 за исключением того, что на вторые сутки в процессе ферментации при достижении 40-50 г сырой биомассы в 1 л среды осуществляют снижение уровня растворенного кислорода О₂ в среде до 0,05 г/л ч при понижении температуры среды до 21^оС, выдерживают в этих условиях в течение 2 ч и по окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,05 NaHCO₃ 0,05 KCl 0,005 MgSO₄ 0,005 MnSO₄ 0,002 ZnSO₄ ˙7H₂O 0,005 ЕДТА 0,005 Затем ферментацию продолжают, как указано в примере 1, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л ˙ч и 32^оС. Съем лимонной кислоты составляет 15,24 кг/м³ ˙сут, что составляет 127,9% по отношению к контролю (пример 1). П р и м е р 3. Условия те же, что в примере 2. Исключение составляет то, что снижение уровня растворенного кислорода О₂ в среде осуществляют до 0,1 г/л˙ч при понижении температуры среды до 22^оС. Выдерживают при этих условиях в течение 2,2 ч и по окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,06 NaHCO₃ 0,06 KCl 0,006 MgSO₄ 0,006 MnSO₄ 0,003 ZnSO₄ ˙7H₂O 0,006 ЕДТА 0,006 Затем ферментацию продолжают, как описано в примере 2, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Съем лимонной кислоты составляет 16,43 кг/м³ ˙сут, что на 37,9% выше, чем в контроле. П р и м е р 4. Условия те же, что в примере 2. Исключение составляет то, что снижение уровня растворенного кислорода О₂ в среде осуществляют до 0,2 г/л ч при понижении температуры среды до 23^оС. Выдерживают при этих условиях в течение 2,5 ч и по окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,07 NaHCO₃ 0,07 KCl 0,007 MgSO₄ 0,007 MnSO₄ 0,004 ZnSO₄˙7H₂O 0,007 ЕДТА 0,007 Затем ферментацию продолжают, как описано в примере 2, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Съем лимонной кислоты составляет 16,05 кг/м³ ˙сут, что на 34,7% выше контроля. П р и м е р 5. Условия те же, что в примере 1. Исключение составляет то, что в процессе ферментации дважды осуществляют снижение уровня растворенного кислорода при понижении температуры среды, выдерживании и введении раствора питательных солей. Первый раз на вторые сутки снижение уровня растворенного кислорода О₂ в среде осуществляют до 0,1 г/л ч при понижении температуры до 22^оС, выдерживают в течение 2,2 ч и по окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей г/л среды: NH₄Cl 0,06 NaHCO₃ 0,06 KCl 0,006 MgSO₄ 0,006 MnSO₄ 0,003 ZnSO₄˙7H₂O 0,006 EДТА 0,006 Затем ферментацию продолжают, как в примере 1, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. На четвертые сутки от начала ферментации при достижении содержания сырой биомассы в 1 л среды 40-50 г снова снижают уровень растворенного кислорода О₂ в среде до 0,1 г/л˙ ч при понижении температуры до 23^оС, выдерживают в течение 2,5 ч и по окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,07 NaHCO₃ 0,07 KCl 0,007 MgSO₄ 0,007 MnSO₄ 0,004 ZnSO₄˙7H₂O 0,007 ЕДТА 0,007 Заканчивают ферментацию при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Съем лимонной кислоты 16,17 кг/м³ ˙сут. П р и м е р 6. Условия те же, что и в примере 2. Исключение составляет то, что в процессе ферментации снижение уровня растворенного кислорода О₂ осуществляют до 0,1 г/л ˙ч при понижении температуры до 22^оС, выдерживают при этих условиях в течение 2,2 ч и без введения раствора питательных солей продолжают ферментацию, как в примере 2, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Съем лимонной кислоты составляет 12,30 кг/м³ ˙сут. П р и м е р 7. Условия те же, что в примере 2. Исключение составляет то, что в процессе ферментации при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,06 NaHCO₃ 0,06 KCl 0,006 MgSO₄ 0,006 MnSO₄ 0,003 ZnSO₄˙7H₂O 0,006 ЕДТА 0,006 Ферментацию проводят в течение 5 сут. Съем лимонной кислоты составляет 12,26 кг/м³˙сут. П р и м е р 8. Ферментация непрерывным способом в соответствии с временной технологической инструкцией (контроль). Условия те же, что в примере 1. Исключение составляет то, что длительность ферментации увеличена до 10 сут путем введения процесса непрерывным способом (путем отъема части культуральной жидкости и долива свежей мелассной среды, начиная с 5 сут процесса). Продуцентом служит плесневой гриб Aspergillus nigers. Выращивание посевного материала культуры продуцента проводят в среде следующего состава, г/л: Меласса 30,0 NH₄Cl 2,2 KH₂PO₄ 0,16 MgSO₄˙7H₂O 0,25 ZnSO₄˙7H₂O 0,005 Ферментацию проводят в условиях аэрации при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Состав среды для ферментации, г/л: Меласса 30,0 NH₄Cl 1,7 KH₂PO₄ 0,12 ZnSO₄˙7H₂O 0,005
Для обработки 300 г мелассы используют 1,6 г желтой кровяной соли и 0,5 н. щавелевокислый аммоний. Ферментацию ведут в течение 10 сут. Съем лимонной кислоты составляет 10,78 кг/м³˙сут (100%). П р и м е р 9. Условия те же, что в примере 8. Исключение составляет то, что длительность ферментации увеличена до 17 сут путем ведения процесса непрерывным способом. В течение ферментации интенсификацию процесса проводят дважды на 5 и 10 сут. Снижение уровня растворенного кислорода О₂ в среде до 0,1 г/л ˙ч проводят при понижении температуры среды до 22^оС. При этих условиях выдерживают культуру в течение 2,2 ч. По окончании выдерживания вводят водный раствор со следующим содержанием питательных солей, г/л среды: NH₄Cl 0,06 NaHCO₃ 0,06 KCl 0,006 MgSO₄ 0,006 MnSO₄ 0,003 ZnSO₄˙7H₂O 0,006 ЕДТА 0,006
После стимуляции процесса на 5 и 10 сут ферментацию ведут, как описано в примере 8, т.е. при уровне растворенного кислорода О₂ 6 г/л˙ч и 32^оС. Длительность ферментации 17 сут. Съем лимонной кислоты составляет 14,21 кг/м³˙сут, что на 81,7% выше, чем в контроле (пример 8).

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, предусматривающий выращивание гриба-продуцента Aspergillus niger в среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, источник азота и минеральные соли, в условиях аэрирования и поддержания температуры до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, в процессе выращивания при переходе культуры в стационарную фазу осуществляют снижение аэрации до содержания растворимого молекулярного кислорода в среде 0,05 0,2 г/л · ч при одновременном понижении температуры до 21 23^oС и выдерживание при этих условиях осуществляют в течение 2 2,5 ч, а затем вводят смесь минеральных солей, состоящую из хлористого аммония, двууглекислого натрия, хлористого калия, сернокислого магния, сернокислого марганца, сернокислого цинка, а также этилендиаминтетраацетата, при следующем соотношении ингредиентов, г/л среды:
Хлористый аммоний 0,05 0,07
Двууглекислый натрий 0,05 0,07
Хлористый калий 0,005 0,007
Сернокислый магний 0,005 0,007
Сернокислый марганец 0,002 0,004
Сернокислый цинк 0,005- 0,007
Этилендиаминтетраацетат 0,005- 0,007

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 14-2002

Извещение опубликовано: 20.05.2002        

---