Способ получения тромболитического фермента из гриба тriснотесiuм rоsеuм штамм d
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК .
„„ЯО„„1421348 (51)4 A 61 К 37/48 С 12 N 9/58
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ИЗ ГРИБА TRICHOTECIUM
R0SEUM IIlTAMM D (57) Изобретение относится к производству ферментных препаратов и может быть использовано в медицине. С целью получения фермента триазы повышенной
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4169377/28-13 (22) 24. 12.86 (46) 07.09.88. Бюл. У 33 (71) Центральный научно-исследовательский институт гематологйи и переливания крови (72) Н.С.Мурашова, И.В.Иванова, M.À.Êoçëoâà, A.Â.Ñèðîòåíê0, P.À.Màêñèìoâà, Г.В.Андреенко, Е.В.Макарова и В.И.Данилина (53) 577. 15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
N 584034, кл. С 12 N 9/72, 1975.
Авторское свидетельство СССР
N 787463, кл. С 12 N 9/00, 1978 ° степени очистки из культуральной жидкости Trichotecium roseum штамм D осадок триазы растворяют в 0,2 M натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,2, пропускают через анионообменник гемосорбент СКН, затем катионообмен-. ник — биокарб Л, проводят отмывку катионообменника от балластных б".íêîâ с помощью 0,1 М натрий-ацетатного буфера рН 4,0-4,2 и десорбцию проводят
0,2 М аммоний-ацетатным буфером рН, 8,0-8,4, полученный раствор фермента подвергают стерилизующей фильтра ции и лиофильной сушке. Получают апирогенную триазу, состоящую из 2 индивидуальных белков с молекулярными массами 93С0 и 17300 дальтон в отличие от исходной триазы, состоящей из 7 индивидуальных белков. Преимущество предложенного способа заключается не только в повышении степени очистки фермента, но и в использовании для очистки дешевого сырья и дешевых отечественных анионои катионообменников. 1 ил., 4 табл.
1421348
Изобретение относится к производству фермеНтных препаратов и может быть использовано в медицине.
Цель изобретения — повышение сте5 пени очистки фермента тромболитического действия, Сущность способа заключается в том, что исходный продукт, в качестве которого используют осадок триазы, полученный в результате спиртового осаждения культуральной жидкости
Trichotecium roseum штамм D, растворяют в 0,2 M натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,2 (данные значения рН обес-15 печивают наиболее полное растворение осадка) . Ha 20-25 r осадка берут
300-350 мл буфера. Нерастворившуюся часть осадка отделяют путем фильтрации через бумажный фильтр. Весь экст- 20 ракт наносят на колонку с анионообменником. В качестве анионообменника подобран гемосорбент СКН. Отработан режим хроматографии: диаметр колонки
22 мм, высота разделяющего слоя 80- 25
90.мм, скорость сорбции 100-120 мл/
/ч/см . Собирают фракции по 10-13 мл, в которых определяют рН, Фракции, имеющие рН больше, чем исходные значения буфера (4,0-4,2) отбрасывают, 30 а остальные фракции объединяют и наносят на колонку с катионообменником.
В качестве катионообменника подобран биокарб Л.. Диаметр колонки 22 мМ, высота разделяющего слоя 40-50 мм, скорость сорбции 100-120 мл/ч/см .
После сорбции колонку промывают
0,1 M раствором натрий-ацетатного буфера рН 4,0-4,2 со скоростью 4р
50-60 мл/ч/см . Десорбцию триазы проводят с помощью 0,2 М аммоний-ацетатного буфера рН 8,0-8,2 (при данных значениях рН наблюдается наиболее полное снятие с колонки нанесенного материала). Собирают фракции 10-15 мл, в которых определяют объем, фибринолитическую активность по методу
Astrup и оптическую плотность при
280 нм (спектрофотометрически).
Фракции, обладающие фибринолитической активностью, объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Затем полученные фракции растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия в количестве, равном объему фракций до сушки и ставят на пироген-тест в соответствии с требованиями Х Государственной Фармакопеи
СССР. Апирогенной считают ту фракцию, которая дает максимальное повышение температуры у одного кролика не вью ше 0,6 С, снижение не больше, чем на 0,3 С, а сумма максимальных повышений у трех кроликов не превышает
1,4 С.
3 л культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза гриба
Trichotecium roseum штамм D, охлаждают до -1 C H o6aa smT 9 96-граб дусного этанола, предварительно охлажденного до -15 С. Конечная темо о пература осаждения -4 С. Устанавливают рН 7,0. Через 18 ч образуется осадок триазы, который отделяют цент рифугированием. Полученный осадок (20 r) растворяют в 300 мл 0,2 М натрий-ацетатного буфера рН 4,0.
Нерастворившуюся часть осадка отделяют при фильтровании через бумажный фильтр.
Затем экстракт в количестве
260 мл наносят на колонку с анионообменником гемосорбентом. Диаметр колонки 22 мм, высота разделяющего слоя 82 мм. скорость сорбции
100 мл/ч/см Сорбируют фракции по
13 мл. Получены 21 фракция. Определяют рН фракций.
В табл. 1 представлены значения рН в различных фракциях триазы.
Фракции, имеющие рН больше 4,0 (с 1-й по 5-ю фракцию), отбрасывают, а фракции с б-й по 21-ю (рН 4,0) объединяют и наносят на колонку с катионообменником биокарбом Л. Диаметр колонки 22 мм, высота разделяющего слоя 44 мм, скорость сорбции 100 мл/ч/см . После сорбции колонку промывают 100 мл 0,1 М раствора натрий-ацетатного буфера со скоростью 50 мл/ч/см2 . Десорбцию триазы проводят с помощью 250 мл 0,2 М аммоний-ацетатного буфера рН 8,2.
Скорость десорбции 20 ип/ч/см . Со-, бирают фракции по 10-15 мл, в которых определяют рН, фибринолитическую активность, оптическую плотность при
280 нм.
В табл. 2 даны результаты хроматографического выделения.триаэы с использованием гемосорбента и биокарба.
На чертеже дан график зависимости фибринолитической активности фракций и их плотности при 280 нм от объема
Ф» фракций.
14213
Таблица 1
Фракция рН
Фракция рН
Фракция рН
9,8
4,0
4,0
7,2
4,0
4,0
4,0
4,0,6,3
4,0
4,0
4,0
5,5
4,0
4,1
4,0
20
4,0
4,0
4,0
4,0
Как видно из чертежа, получают
2 пика фибринолитической активности и соответствующие им 2 пика белка.
:Фракции, входящие в состав этих
5 пиков, объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Затем лиофильно высушенный фермент растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия в количестве, равном объему раствора до сушки, и полученный раствор вводят внутривен:f но кролику для постановки пирогентеста согласно Х Государственной
Фармакопее СССР. 15
В табл. 3 представлены данные по температурной реакции кроликов на введение триазы.
Максимальное повышение температу-! о ры у одного кролика для 2 пика О, 6 С, а суммы максимальных повышений температуры у 3 кроликов 1,2 С, что характеризует 2 пик как апирогенный. 1 пик дает пирогенную реакцию (максимальное повышение температуры у 1 кролика 25
1,5 С,а сумма максимальных повышений
3,3 С).
В табл. 4 представлены данные по температурной реакции кроликов на введение триазы, полученной при использовании 2,схем очистки.
Как видно из данных табл. 4, именно сочетание гемосорбента и биокар ба Л обеспечивает получение апирогенной триазы.
Сравнение белкового состава апи35 рогенной триазы и триазы, описанной в прототипе и используемой как ис"
48 4 ходный продукт в предлагаемом способе, показало, что в отличие от исходной триазы, состоящей из 7 индивидуальных белков, в состав апирогенной триазы входят 2 индивидуальных белка, с молекулярными массами 9300 и
17300 дальтон, что свидетельствует о повышении степени очистки триазы за счет удаления ряда белков.
Преимущество предлагаемого способа заключается в использовании доступных дешевых отечественных анионо- и катионнообменников и сырья и получении апирогенного фермента высокой степени очистки.
Формула и з о б р е т е н и я
Способ получения тромболитического фермента из гриба Trichotecium roseum штамм D, включающий осаждение целевого продукта из культуральной жидкости органическим растворителем и отделение фибринолитического осадка, очистку, стерилизующую фильтрацию и лиофильную сушку, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения степени ецио очиcòêè, осадок растворяют в 0,2 М натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,?, очистку ведут пропусканием через ачионообменпик гемосорбент СКН, затем катионаабменник — биокарб Л, проводят отмывку катионообменника от балластных белков с помощью 0,1 М того же буферa с десорбцией 0,2 М аммоний-ацетатным буфером рН 8,0-8,2.
1421348
Таблица 2. X. v .1у рН чс .f мл
Е780
ФА
Фракция
V мл
13,2
4,45
0,9
13,2
225
1,6
100
4,52
4,70
2,3
225
4,92
410
3.3
425
5,21
4,3
5,53
3,1
300
12,8
78,0
О, 100
283
5,85
5,9
6,15
0,050
6,6
200
100
6,42
0,030
7,4
6,90
8,4
7,10 9,2
9,9
7,32
10,5 . 150 3
7,85
10,7
13,4 163,7
12,5 176,2
11,6
8,10
130 1892
8,40
12,4
8, 40
13,5 202, 7
13,3
40,0 39,2 40,.1
0,7 0,3 0,8
40,6 40,9 40,5 . 1,2 1,5 1, 1
1 пик
40 1 40,3 40,3
1,0 1,0
0,8
0,6 0,5 0,3
0,4 0,3 0,0
39э6 39 5 39э3
39,6 39,5 39,2
2 пик
-0,2
0,2
10,5 23,7
12,0 35,7
14,5 50,2
15 0 65,2
11,5 89,5
10,7 100,2
13,1 113,3
14,3, 127,6
12,2 139,8
1 1800 1 8 39 3
2 1757 1,8 39,4
3 1850 1 9 39,3
4 1700 1,7 39, О
5 1750 1,8 39,2
6 1800 1,8 39, 1
39 0 38 9 39 ° 3 Оэ1
О, 130
0,060
О, 140
0,670
0,850
0,700
0,030
0,035
0,020
0,015
0,010
0,010
0,010
Таблица 3.
1421348
Разница .температур до и после введения триазы
Номер кролика
Схема очистки
Гемосорбент и биокарб Д
0,4
0,9
0,9
0,6
0,8
0,8
1,0
Гемосорбент и биокарб Л
0,6
0,3
0,5
0,4
0,0
0,3
0,2
-0,2
-0,1
Р,б
01
1 Г,7 Ф,7 Ю 7 Ю Я 101113,УHQ 16
Составитель В. Соина
Техред А.Кравчук Корректор И. Муска
Редактор С. Пекарь
Заказ 4358/4
Тираж 655 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул. Проектная, 4 280
ЮУ
Таблица 4
